細胞特異的遺伝子導入システムを用いた神経堤細胞の発生分化に関わるシグナルの解析

使用细胞特异性基因转移系统分析与神经嵴细胞发育分化相关的信号

• 批准号: 13780592
• 负责人: 福原 茂朋
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780592/
• 关键词: 神経堤細胞; エンドセリン; レトロウイルス; TVA; 遺伝子導入; 鰓弓; シグナル伝達

エンドセリン-1(ET-1)/ETA受容体(ETAR)シグナルは、鰓弓形成に関与する頭部神経堤細胞の発生に重要な役割をしているが、その分子機序については不明な点が多く残されている。本研究では、この疑問を解明するため(1)ETARを発現する頭部神経堤細胞のgreen fluorescence protein (GFP)によるマーキングおよび(2)これら細胞への特異的な遺伝子導入システムの開発を行なった。まず、(1)の系を開発するためETARプロモーターによってGFPが発現するトランスジェニックマウス(ETAR/GFP Tgマウス)を作製した。このETAR/GFP Tgマウス胚を解析した結果、ETARを発現する頭部神経堤細胞においてGFPの発現が認められた。また、ETRAは血管平滑筋細胞にも発現することが知られているが、ETAR/GFP Tgマウスの各種血管においてもGFPの蛍光が観察され、これらGFP陽性細胞はETARを発現する血管平滑筋細胞であることが示された。よって、我々はGFPによるin vivoでのETRA発現細胞のマーキングに成功し、さらにFACS技術を併用することによりこれら細胞の単離を可能にした。ついで、Rcas-TVAシステムを応用して(2)の開発を試みた。TVAはトリレトロウイルス受容体であり、哺乳動物細胞はこの遺伝子を持たないが、TVAを外来的に発現させることによりRcasウイルスによる感染を受けるようになる。そこで、ETARプロモーターによってTVAが発現するトランスジェニックマウスを作製し、ETAR発現細胞特異的遺伝子導入システムの開発を試みた。このマウスの胎仔線維芽細胞系、鰓弓器官培養系、全胚培養系におけるRcasGFPウイルス感染による遺伝子導入効率を検討した結果、すべての系においてGFPの発現が観察され、その有用性が示唆された。今後、これらのシステムを用いて神経堤細胞の発生におけるET-1/ETARシグナルの解析を進めていく。

内皮素-1（ET-1）/ETA受体（ETAR）信号传导在参与鳃弓形成的颅神经嵴细胞的发育中发挥着重要作用，但其分子机制仍不清楚。在本研究中，为了澄清这个问题，我们（1）用绿色荧光蛋白（GFP）标记表达 ETAR 的颅神经嵴细胞，并（2）开发了一种特定的基因导入系统到这些细胞中。首先，为了开发系统(1)，我们创建了转基因小鼠(ETAR/GFP Tg小鼠)，其中GFP由ETAR启动子表达。对 ETAR/GFP Tg 小鼠胚胎的分析表明，GFP 在表达 ETAR 的头部神经嵴细胞中表达。还已知ETRA在血管平滑肌细胞中表达，并且在ETAR/GFP Tg小鼠的各种血管中也观察到GFP荧光，并且这些GFP阳性细胞是表达ETAR的血管平滑肌细胞。因此，我们成功地在体内用GFP标记表达ETRA的细胞，并通过结合FACS技术，我们能够分离这些细胞。接下来，我们尝试应用Rcas-TVA系统来开发(2)。 TVA是禽类逆转录病毒受体，虽然哺乳动物细胞不具有该基因，但TVA的外源表达使其容易受到Rcas病毒的感染。因此，我们创建了由ETAR启动子表达TVA的转基因小鼠，并尝试开发针对ETAR表达细胞的特异性基因转移系统。在该小鼠的胚胎成纤维细胞系统、鳃弓器官培养系统和全胚胎培养系统中检查RcasGFP病毒感染的基因转移效率，结果在所有系统中观察到GFP表达，表明其有用性。将来，我们将使用这些系统来分析神经嵴细胞发育过程中的 ET-1/ETAR 信号。

项目成果

Chikumi et al.: "Regulation of G protein-linked guanine nucleotide exchange factors for Rho, PDZ-RhoGEF and LARG, by tyrosine phosphorylation : Evidence of a role for FAK"J. Biol. Chem.. (in press).

Chikumi 等人：“通过酪氨酸磷酸化调节 Rho、PDZ-RhoGEF 和 LARG 的 G 蛋白连接鸟嘌呤核苷酸交换因子：FAK 作用的证据”J.

Fukuhara et al.: "RGS-containing RhoGEFs : The missing link between transforming G proteins and Rho ?"Oncogene. 20. 1661-1668 (2001)

Fukuhara 等人：“含有 RGS 的 RhoGEF：转化 G 蛋白和 Rho 之间缺失的联系？”癌基因。

Yamaguchi et. et al.: "A novel mouse β-defensin, mBD-6, predominantly expressed in skeletal muscle"J. Biol. Chem.. 276. 31510-31514 (2001)

Yamaguchi 等人：“一种新型小鼠 β-防御素，mBD-6，主要在骨骼肌中表达”J. Biol. 276. 31510-31514 (2001)

Chikumi et al.: "Regulation of G protein-linked guanine nucleotide exchange factors for Rho, PDZ-RhoGEF and LARG, by tyrosine phosphorylation : Evidence of a role for FAK"J.Biol.Chem.. 227. 12463-12467 (2002)

Chikumi 等人：“通过酪氨酸磷酸化调节 Rho、PDZ-RhoGEF 和 LARG 的 G 蛋白连接鸟嘌呤核苷酸交换因子：FAK 作用的证据”J.Biol.Chem.. 227. 12463-12467 (2002

Yamaguchi et al.: "Identification of multiple novel epididymis-specific β-defensin isoforms in the humans and mice"J.Immunol.. 169. 2516-2523 (2002)

Yamaguchi 等人：“人类和小鼠中多种新型附睾特异性 β-防御素亚型的鉴定”J.Immunol.. 169. 2516-2523 (2002)