核蛋白質輸送効率制御機構の解析

核蛋白转运效率调控机制分析

基本信息

批准号：
13780572
负责人：
立花太郎
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780572/
关键词：
核移行シグナルリン酸化 Ran

项目摘要

これまでに競合阻害がおこらない程度の核蛋白質(核移行シグナル)を細胞質に導入すると、全体の核蛋白質輸送効率が上昇するという現象を見いだし、それが核移行シグナル(NLS)依存的なリン酸化反応に依存することを明らかにしている。本現象の分子メカニズムを解明するため、核移行シグナル依存的にリン酸化されるタンパク質の同定を行った。これまでに知られている核蛋白質輸送に関与する因子の中から核移行シグナル依存的にリン酸化されるものを検索した結果、RanGAP1ならびにRanBP3が細胞質抽出液中において核移行シグナル依存的にリン酸化されることがわかった。RanGAP1、RanBP3ともに低分子量G蛋白質Ranの制御因子である。低分子量G蛋白質Ranは核蛋白質輸送過程において中心的な役割を果たす因子であり、その制御蛋白質が核移行シグナル依存的にリン酸化されることは核蛋白質輸送効率制御機構を考える上で非常に興味深い。そこで、RanGAP1、RanBP3の細胞内での機能をさらに解析するため、各因子に対するモノクローナル抗体の作製を試みた。これまで核蛋白質輸送因子に対するモノクローナル抗体の作製は主にマウスを用いられてきたが、その抗原性の低さなどからあまり成功していない。そこで、本研究ではラットリンパ節由来のリンパ球を用いて抗体の作製を行ったところ、各因子に対する特異的な抗体を合成するハイブリドーマ細胞を樹立することに成功した。各抗体の性質を検討したところ、これらの抗体は核蛋白質輸送効率制御機構を明らかにするためのツールとして非常に有用であることがわかった。

到目前为止，我们已经发现，当将核蛋白（核转运信号）引入细胞质中时，至今不会导致竞争性抑制，总体核蛋白转运效率提高，并且已经表明，这取决于核转运信号（NLS）依赖性磷酸化反应。为了阐明这种现象的分子机制，我们确定了以核转运信号依赖性方式磷酸化的蛋白质。我们搜索了以核蛋白转运的涉及的先前已知因素，这些因素以核转运信号依赖性方式磷酸化，并发现rangap1和ranbp3在细胞质提取物中以核转运信号依赖性方式磷酸化。 rangap1和ranbp3都是低分子量G蛋白RAN的调节剂。低分子量G蛋白RAN是在核蛋白转运过程中起着核心作用的因素，并且在核转运信号依赖性方式中调节蛋白的磷酸化在考虑控制核蛋白转运效率的机制方面具有极大的兴趣。因此，为了进一步分析rangap1和ranbp3的细胞内功能，我们试图为每个因素生成单克隆抗体。到目前为止，针对核蛋白转运因子的单克隆抗体主要用于小鼠，但由于其低抗原性，它尚未成功。因此，在这项研究中，使用源自大鼠淋巴结的淋巴细胞制备抗体，并成功确定杂交瘤细胞的杂交瘤细胞合成了每个因子的特定抗体。检查了每种抗体的特性，发现这些抗体非常有用，因为可以阐明控制核蛋白运输效率的机制。