タンパク質フォールディングに対する天然状態類似相互作用の役割のNMRによる研究

核磁共振研究天然态相互作用对蛋白质折叠的作用

基本信息

批准号：
13780529
负责人：
水口峰之
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

(目的)本研究の目的は、タンパク質フォールディングにおける部分的天然構造の役割を理解することである。そのために、α-ラクトアルブミンのD-ヘリックスをウマリゾチームのD-ヘリックスのアミノ酸配列に置換したキメラ蛋白質を作製し、モルテングロビュール状態での非天然構造を天然構造へと変化させる。重水素交換ラベル法と2次元NMR法を組み合わせた方法を用いることによって、キメラ蛋白質のフォールディング反応を残基レベルで追跡し、モルテングロビュール状態の部分的天然構造がタンパク質フォールディングにどのような影響を与えるのか調べる。さらにNMRを用いてキメラ蛋白質の運動性解析や立体構造解析を行い、ヘリックス置換の影響について調べる。(結果)マニュアルミキシングによる重水素交換ラベルを行うには、タンパク質フォールディングが十分遅い反応である必要がある。まずはキメラタンパク質のフォールディング反応を遅くすることを試みた。アルコールなどの有機溶媒や様々な塩を加えることによってフォールディング反応がどのように変化するのか調べたが、変性する速度に著しい違いが現れる条件をいくつか見つけるにとどまった。巻き戻り速度(リフォールディング速度)については、マニュアルミキシングを可能にするほど反応を遅くすることができなかった。15Nで安定同位体標識したキメラタンパク質を用いてT1,T2,NOE測定を行い、モデルフリー解析を行うことによって主鎖の運動性を解析した。その結果、キメラタンパク質のD-ヘリックスの運動性は著しく制限されており、ピコ秒〜ナノ秒の運動、マイクロ秒〜ピコ秒の運動性が共に低いことを明らかとした。運動性やフォールディング反応と立体構造との関連を調べるためにキメラタンパク質のNMRデータから立体構造を決定しようと試みた。現在NOEピークの帰属中であり、また、変異を導入したD-ヘリックス近傍では、野生型と比較してNOEのパターンが異なることを見出した。

（目的）本研究的目的是了解部分天然结构在蛋白质折叠中的作用。为此，产生一种嵌合蛋白，其中α-乳阳性蛋白的D螺旋被马溶菌酶的D螺旋的氨基酸序列取代，而莫氏溶菌蛋白的D螺旋蛋白则将其在莫尔氏蛋白的D-序列中更改为自然结构中的非天然结构。通过使用氘交换标记和二维NMR方法的组合，在残基水平上跟踪嵌合蛋白的折叠反应以及形态环状状态的部分天然结构如何影响蛋白质折叠。此外，将使用NMR进行嵌合蛋白的运动分析和构象分析，以研究螺旋取代的影响。（结果）要通过手动混合执行氘交换标记，反应必须足够慢，以产生足够慢的蛋白质折叠。首先，我们试图减慢嵌合蛋白的折叠反应。我们研究了折叠反应如何随添加有机溶剂（例如醇和各种盐）而变化，但仅发现一些条件显示出变性速率显着差异。关于重折叠速度，响应不能放慢速度，以允许手动混合。使用稳定的同位素标记为15N的嵌合蛋白测量T1，T2和NOE，并进行了无模型分析以分析主链的运动性。结果，揭示了嵌合蛋白的D螺旋的运动能力明显有限，并且皮秒纳秒运动和微秒picosecond的运动性都较低。我们试图确定嵌合蛋白NMR数据的构象来研究运动与折叠反应与构象之间的关系。我们发现，当前正在分配NOE峰，NOE的模式与引入突变的D螺旋附近的野生型不同。