アミロイド前駆体蛋白(APP)の変異特異的に分泌される新規sAPPCの機能解析

淀粉样前体蛋白 (APP) 突变特异性分泌的新型 sAPPC 的功能分析

基本信息

批准号：
13771399
负责人：
城谷圭朗
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771399/
关键词：
アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白老化

项目摘要

新規分子sAPPC(アミロイド前駆体蛋白のC末部を含む分泌型)の機能を神経細胞で解析するため、常法に従いマウス大脳皮質の初代神経細胞培養法を確立した。神経細胞特異的なMAP2抗体とアストロサイト特異的なGFAP抗体を用いた免疫細胞染色の結果95%以上が神経細胞であったことから本実験の用途に適していると判断した。そこで293細胞由来のsAPPCを含む未精製の培養上清を1/2、1/4、1/8に希釈してマウス初代神経細胞に添加後、細胞の経過観察を行った。しかしながらsAPPCを含まない対照の293細胞培養上清を添加した神経細胞でも1日後に細胞死が観察された。これより293細胞の培養上清中には神経細胞毒性を持つ因子が存在し、sAPPCの機能を調べるにはsAPPCを精製しなければならないことがわかった。精製を行うためにはヘパリンカラムが有効であることがわかっているが、ヘパリンカラムだけではsAPPαやsAPPβも共精製されるのでsAPPCのみに反応する抗体すなわちAPPの細胞内部位を認識する抗体を作成した。その結果アフィニテイー精製に使用できる抗体価の高い抗体が得られた。一方、これまでにsAPPCはスウエーデン型変異を持つAPPを安定に発現する293細胞が分泌し野生型APPからは分泌されないことを示したが、アルツハイマー病の他の変異についてもsAPPCが分泌されるかを調べた。まずロンドン型とオランダ型変異を持つAPPを安定に発現する293細胞を得た。そしてその培養上清のヘパリン沈降物をAPPのC末部の抗体でウエスタンブロットしたところ、ロンドン型とオランダ型変異からはsAPPCが分泌されないことがわかった。よってsAPPCの分泌はアルツハイマー病で見つかっている全てのAPP変異に共通の現象ではないことがわかった。

为了分析新型分子sAPPC（一种含有淀粉样前体蛋白C末端的分泌形式）在神经元中的功能，我们建立了一种用常规方法培养小鼠大脑皮层原代神经元的方法。使用神经元特异性 MAP2 抗体和星形胶质细胞特异性 GFAP 抗体进行免疫细胞染色，结果显示 95% 以上的细胞是神经元，因此我们判断这些细胞适合用于本实验。因此，将含有源自293细胞的sAPPC的未纯化培养上清液稀释至1/2、1/4和1/8并添加到小鼠原代神经细胞中，然后随时间观察细胞。然而，在添加不含sAPPC的对照293细胞培养上清液的神经细胞中，1天后也观察到细胞死亡。这表明293细胞培养上清液中存在对神经元细胞有毒的因子，并且必须纯化sAPPC才能研究其功能。尽管已知肝素柱可有效纯化，但由于肝素柱单独共纯化 sAPPα 和 sAPPβ，因此有必要创建仅与 sAPPC 反应的抗体，即识别 APP 细胞内位点的抗体。结果，获得了可用于亲和纯化的具有高抗体效价的抗体。另一方面，我们之前已经证明，sAPPC 是由稳定表达具有瑞典突变的 APP 的 293 细胞分泌的，但我研究过的不是来自野生型 APP。首先，我们获得了稳定表达APP且具有London和Dutch突变的293个细胞。使用针对 APP C 末端的抗体对培养物上清液的肝素沉淀物进行蛋白质印迹分析，结果显示 sAPPC 不是由 London 和 Dutch 突变分泌的。因此，发现sAPPC的分泌并不是阿尔茨海默病中发现的所有APP突变中的常见现象。