電離放射線によるDNA障害修復過程における複製制御酵素Cdc7の動態解析

复制控制酶Cdc7在电离辐射引起的DNA损伤修复过程中的动态分析

• 批准号: 13771115
• 负责人: 角 忠輝
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771115/
• 关键词: Cdc7; Dbf4; 細胞周期; 放射線障害; UV; 細胞分化

今年度は、電離放射線および紫外線によるDNA障害の際に認められる、内在性のヒトCdc7並びにその調節因子であるDbf4の動態解析を行った。使用した細胞株は(1)ヒト白血病細胞株(U937,HL60)、(2)ヒト正常肺線維芽細胞株(IMR-90)、(3)ヒト毛細血管拡張性運動失調症皮膚細胞株(AT3BI, GMO2052A)である。結果は以下の通りである。1.Cdc7の基質であるMCM2タンパクに対する抗体を用いてウェスタンブロッティング法によりその発現量を観察したところ、分化誘導時にはどの細胞株でも遅くとも24時間以内に発現量は減少した。2.細胞周期の制御に関与するpRBタンパクとヒトCdc7の直接的な働きを調べるために、免疫沈降法を用いてウェスタンブロッティングを行ったが、両者に直接的な結合は見られなかった。3.DNA障害や分化誘導時に見られるCdc7の発現量の変化が、Cdc7タンパクのUbiquitinationとどのような関係を有しているかについて、プロテアソームインヒビターであるLactacystinを用いてその機序を調べた。プロテアソームの機能が阻害されているにもかかわらず、Cdc7の発現量に変動が見られたことから、Cdc7の発現制御がタンパク合成以前に行われている可能性が示唆された。4.RDS (Radioresistant DNA Synthesis)の状態を観察するため、上記1.(2)並びに(3)の細胞株に電離放射線照射を行い、ウェスタンブロッティング法により細胞内のCdc7の分布を観察した。Cdc7タンパクの発現は正常細胞では2時間の後に減少するが、AT3BI, GMO2052Aの両細胞株では発現に変動は無かった。

今年，我们对内源性人CDC7及其调节因子DBF4进行了动态分析，这在电离辐射和紫外线引起的DNA损伤中观察到。所使用的细胞系为（1）人类白血病细胞系（U937，HL60），（2）人类正常肺成纤维细胞细胞系（IMR-90）和（3）（3）telangiectasia telangiectasia skin细胞系（AT3BI，GMO2052A）。结果如下：1。使用蛋白质抗体对MCM2蛋白的抗体观察到表达水平时，CDC7的底物时，在分化诱导期间，最近24小时在24小时内降低了表达水平。 2。使用免疫沉淀进行蛋白质印迹，以研究参与细胞周期调节和人类CDC7的PRB蛋白的直接功能，但在两者之间未发现直接结合。 3。使用蛋白酶体抑制剂乳糖素，在DNA损伤和分化诱导过程中观察到的Cdc7表达水平变化的机制与Cdc7蛋白的泛素化具有关系。尽管抑制了蛋白酶体功能，但仍观察到CDC7表达水平的波动，这表明CDC7表达可以在蛋白质合成之前受到控制。 4。要观察RD的状态（放射性DNA合成），细胞线1。（2）和（3）被电离辐射照射，并通过Western blotting观察到细胞内Cdc7的分布。正常细胞中2小时后，CDC7蛋白的表达降低，但AT3BI和GMO2052A细胞系的表达都没有变化。