ホスホリパーゼCを介する光情報伝達系における蛋白間相互作用

磷脂酶 C 介导的光转导系统中蛋白质-蛋白质相互作用

基本信息

批准号：
13640688
负责人：
鈴木龍夫
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Hyogo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1、分離したラブドーム膜から高塩濃度溶液で表在性蛋白を洗い出した後、1%Octylglucosideで抽出して、ロドプシンとG-蛋白を主成分とする蛋白溶液を得た。この溶液に精製したホスホリパーゼCを加え、緩衝液で希釈することにより、ロドプシン-G-蛋白-ホスホリパーゼC反応系を再構成した。[3H]-PIP2を基質にしてホスホリパーゼC活性を測定し、その活性は光とGTPにより促進されることを確認した。2、低塩濃度および高塩濃度溶液で抽出された蛋白溶液を、イオン交換とゲル濾過クロマトで分画し、上記再構成反応系におよぼす効果を見た。ホスホリパーゼC活性を促進した2分画をさらに細分画した結果、1つは水溶性(細胞質)G-蛋白と同定された。もう一方の分画中の活性成分は未同定である。3、上記再構成反応系に精製したロドプシンキナーゼを加えた系では、ATP存在下でホスホリパーゼC活性が抑制された。ホスホリパーゼC活性の変化を指標にして、リン酸化ロドプシンと相互作用する蛋白を検索したが、相当する分画は得られなかった。4、抗ロドプシン抗体を用いた免疫沈降法により、リン酸化ロドプシンと結合する蛋白を検索したが、相当する蛋白を見出せなかった。5、以上の結果から、現在未同定ではあるが、ロドプシン-G-蛋白-ホスホリパーゼC反応系を促進する蛋白が存在することが示唆された。リン酸化ロドプシンと結合するアレスチン様蛋白は存在せず、リン酸化のみでG-蛋白との相互作用が弱まる可能性が示唆された。

1。用高盐浓度溶液从分离的rhab圆顶膜上洗涤浅表蛋白后，将蛋白质溶液用1％辛基葡萄糖苷萃取，以获得含有Rhodopsin和G蛋白作为主要成分的蛋白质溶液。将纯化的磷脂酶C添加到该溶液中，并用缓冲液稀释，以重建视紫红质-G蛋白磷脂酶C反应系统。使用[3H] -PIP2作为底物测量磷脂酶C活性，并证实其活性是通过光和GTP促进的。 2。通过离子交换和凝胶过滤色谱法分离以低盐和高盐浓度溶液提取的蛋白质溶液，以查看上述重新建立反应系统的作用。促进磷脂酶C活性的两个级分进一步亚分置，并确定为水溶性（细胞质）G蛋白。另一部分中的活性成分未识别。 3。在将纯化的视紫红质激酶添加到上述重构反应系统的系统中，在ATP存在下抑制了磷脂酶C活性。使用磷脂酶C活性的变化作为指标，搜索了与磷酸化的视紫红质相互作用的蛋白质，但未获得相应的馏分。 4。通过使用抗红肖蛋白抗体的免疫沉淀来搜索与磷酸化的二白蛋白结合的蛋白质，但未发现相应的蛋白质。 5。以上结果表明，尽管目前尚未鉴定，但仍有一种蛋白质促进珠宝素 - 蛋白 - 磷脂酶C反应系统。没有抑制蛋白与磷酸化的视紫红蛋白结合的抑制蛋白，这表明单独磷酸化可能会削弱与G蛋白的相互作用。