早老症:ウェルナー症候群原因遺伝子産物の機能の分子レベルでの解析

早衰症：在分子水平上分析引起维尔纳综合征的基因产物的功能

基本信息

批准号：
01J07982
负责人：
川辺洋一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J07982/
关键词：
ウェルナー症候群 WHIP AAA^+ATPase family Two-hybrid Screening DT40 DNA二本鎖切断修復 Ku70 XRCC3

项目摘要

1 WHIPと相互作用するタンパク質の同定WHIP相互作用タンパク質を同定することを目的にTwo-hybridスクリーニングを行い、WHIP自身での結合を明らかにした。また、ゲル濾過カラムでの解析でWHIPは六量体を形成することを明らかにした。申請者はWRNとWHIPの結合にはATP結合モチーフが重要であることを既に示しているが、このWHIPの六量体形成にはATP結合モチーフの関与がないことを明らかにした。2 ニワトリDT40細胞を用いたWRNとWHIPの遺伝学的解析WHIP/WRN二重破壊株を作成し、細胞増殖能と4NQOへの感受性を測定したところ、WRN単独破壊株で見られた細胞増殖能の低下と4NQOへの高感受性が部分的に回復することを見出した。これによりWRNの関わる経路においてWHIPがWRNの上流で機能することが明らかになった。3 ニワトリDT40細胞を用いたWRNとDNA二本鎖切断修復因子との遺伝学的解析WRNと二本鎖DNA修復経路に関わるタンパク質群(Ku70,XRCC3,DNA-PKcs, Lig4)との遺伝子二重破壊株の樹立を行い、現在までにすべての遺伝子破壊株の樹立を終了した。現在までにKU70/WRNとXRCC3/WRN二重破壊株について細胞増殖能、細胞傷害剤(MMS, Cisplatin,4NQO)への感受性を測定した。細胞増殖能についてはそれぞれの単独破壊株より両二重破壊株とも増殖能の低下が見られた。薬剤感受性については、WRN単独破壊株ではすべての薬剤に対して感受性を示すが、KU70/WRN二重破壊株においてはKU70単独破壊株と同様にすべての薬剤に対してWTより抵抗性を示した。一方、XRCC3/WRN二重破壊株ではすべての薬剤に対して感受性は相加的であった。

1 与 WHIP 相互作用的蛋白质的鉴定我们进行了双杂交筛选来鉴定 WHIP 相互作用的蛋白质，并揭示了 WHIP 本身的结合。此外，凝胶过滤柱分析表明WHIP形成六聚体。尽管申请人已经表明ATP结合基序对于WRN和WHIP的结合很重要，但我们现在已经澄清ATP结合基序不参与WHIP的六聚体形成。 2 使用鸡 DT40 细胞对 WRN 和 WHIP 进行遗传分析当我们创建 WHIP/WRN 双破坏菌株并测量其细胞增殖能力和对 4NQO 的敏感性时，我们发现在仅 WRN 破坏菌株中观察到的细胞增殖能力我们发现4NQO 的降低和对 4NQO 的高敏感性得到部分恢复。这表明 WHIP 在涉及 WRN 的通路中在 WRN 上游发挥作用。 3 使用鸡 DT40 细胞对 WRN 和 DNA 双链断裂修复因子进行遗传分析 WRN 和一组参与双链 DNA 修复途径的蛋白质（Ku70、XRCC3、DNA-PKcs、Lig4）之间的基因重复，我们建立了断裂的菌株，并已完成迄今为止所有基因破坏菌株的建立。迄今为止，我们已经测量了KU70/WRN和XRCC3/WRN双破坏菌株的细胞增殖能力和对细胞毒剂（MMS、顺铂、4NQO）的敏感性。关于细胞增殖能力，两种双破坏菌株均表现出比各单破坏菌株更低的增殖能力。关于药物敏感性，WRN单破坏菌株对所有药物均敏感，但KU70/WRN双破坏菌株对所有药物的耐药性均高于WT，与KU70单破坏菌株相似。另一方面，XRCC3/WRN 双破坏菌株对所有药物都具有附加敏感性。