遺伝子相同組み換え中間体Holliday分岐切断機構の立体構造解析

基因同源重组中间体Holliday分支裂解机制的三维结构分析

基本信息

批准号：
01J00507
负责人：
西野達哉
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度はホリデー分岐および複製フォークに作用する古細菌Hefの更なる立体構造解析を行った。まず、HefのN末端より三分の二を占めるヘリカーゼドメインの立体構造解析を行い、原子レベルで立体構造を決定した。Hefのヘリカーゼドメインは構造的に三つのドメインに分けることができ、このうちの二つのドメインはヘリカーゼに共通して見られるフォールドを有していた。これに対して、Hef特異的ドメインは他のヘリカーゼには見られないアルファーヘリックスのみからなるドメインであった。このドメインの機能を調べるため欠失変異体およびアミノ酸残基特異的置換変異体を作成し、ヘリカーゼ活性を測定した。その結果、このドメインはATP加水分解活性を保持していたものの、複製フォークを解消する機能が欠失していた。しかし、興味深いことに、ホリデー分岐の解消機能は有しており、二つのDNA基質間で異なる認識機構が存在していることがわかった。一方、C末端に位置するヘリックスヘアピンヘリックス(HhH)ドメインについても立体構造解析を行い、原子レベルで立体構造を決定した。このドメインは、昨年度の生化学的解析から予想されたように結晶中で二量体を形成していた。その相互作用は今までに知られている様式とは異なり、疎水性相互作用による強固な二量体を形成していた。HhHドメイン変異体を作成したところ、このドメインはヌクレアーゼ活性に必須であった。さらに、タンパク質-DNA相互作用を解析するためフットプリントを行ったところ、ヌクレアーゼドメインはフォーク構造の中心部を認識し、HhHドメインは二重鎖DNAを認識していることがわかった。以上の解析および昨年度までの解析から、ホリデー分岐を切断するHjcタンパク質の立体構造と機能、複製フォークを認識切断するHefの立体構造と機能が明らかになった。これらの結果より、ホリデー分岐や複製フォークがいかにして認識され切断されるかが解明された。

今年，进行了对假日分支和复制叉的古老细菌HEF的进一步分析。首先，在原子水平上确定了HEF的三维结构分析，该分析构成了HEF的N端的三分之二。 HEF螺旋型主体可以在结构上分为三个域，并且两个域具有在解旋酶中以相同方式看到的折叠。另一方面，HEF特异性域是由Alpha Helix组成的域，在其他解旋酶中未发现。为了检查该域的功能，创建了删除的变量和氨基酸残基特异性 - 特异性转化，并测量了解旋酶活性。结果，尽管该结构域保持了ATP水解活性，但消除了副本叉的功能却丢失了。然而，有趣的是，发现假日分支具有功能功能，并且两个DNA底物之间存在不同的识别机制。另一方面，还针对位于E端的螺旋发夹螺旋（HHH）结构域进行了三维结构分析，并在原子水平上确定了三维结构。如去年的生化分析所预期的那样，该域形成了晶体的双重。与迄今为止已知的样式不同，这种相互作用由于疏水相互作用而形成了强大的双体。当创建HHH结构域变体时，该域对于核酸酶活性至关重要。此外，当进行足迹以分析蛋白质-DNA相互作用时，发现核素蛋白酶结构群识别出叉结构的中心，并且HHH结构域识别双链DNA。上面提到的分析和分析直到去年揭示了削减了假日分支的HJC蛋白的三维结构和功能，以及识别副本叉的HEF的三维结构和功能。这些结果表明，假日分支和重复的叉子如何被识别和断开连接。