造血幹細胞・血管新生のシグナル伝達をふくむ分子論的研究

造血干细胞信号转导和血管生成等分子研究

• 批准号: 01J00388
• 负责人: 坂本 比呂志
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J00388/
• 关键词: EphB4; 赤血球; チロシンキナーゼ; 細胞接着; c-CBL; CrkL

チロシンキナーゼは血管新生および造血機能においても重要な働きをしている。なかでも、Ephは哺乳類において巨大なチロシンキナーゼファミリーを形成し、各メンバーの遺伝子破壊マウス(KO)は個体発生の段階においてEphが様々な働きをしていることを示している。EphB4 KOおよびそのリガンドであるEphrinB2 KOは血管の形成異常による胎生致死を示す。EphB4は血管内皮細胞のみならず赤血球の発生段階においても、その発現が赤芽球のBFU-Eに一時的に観察される。そこで、我々はEphB4の赤血球産生における役割を検討するために浮遊細胞を用いた検討を行った。GM-CSF依存性赤白血病細胞株UT-7/GMは内因性にEphB4を発現しており、濃度依存的にEphrinB2をコートしたディッシュに接着し、フィロポディアが亢進した。またEphrinB2はフィブロネクチンによる接着を相加的に亢進し、他のEphメンバーで報告されている接着の阻害を示さなかった。さらに、このフィブロネクチンへの接着機能亢進作用は、EphrinB2を可溶化状態で刺激した際にも観察され、細胞内からの細胞接着機能への調節作用が考えられた。そこで内因性にEphB4を発現していないIL3依存性pro-B細胞株Ba/F3に、EphB4の野生型(EphB4wt)および各種変異型を安定発現させた細胞株を樹立した。EphB4wt発現Ba/F3 (EphB4wt/BF)はUT-7/GMと同様にEphrinB2濃度依存的に接着した。この接着は、チロシンキナーゼ活性を失活させた変異型EphB4発現株(EphB4KD/BF)および細胞内領域を欠損させたEphB4発現株(EphB4dC/BF)においても観察された。また、EPhrinB2依存的な接着時のフィロポディアの形成も、EphB4wt、EphB4KDおよびEphB4dCのすべてで認められた。そこで、次にEphB4による細胞内分子の変化を検討した。UT-7/GMにおいて各種分子のチロシンリン酸化とともに、c-Cblのリン酸化は亢進しCrkLと会合した。EphB4wt/BFおよびEphB4KD/BFにおいても、このEphrinB2依存的なCrkLとc-Cblの結合が観察された。以上の結果から、EphB4は、EphrinB2依存的な接着を示し、その接着はEphB4の細胞内領域に依存していないことが示された。

酪氨酸激酶在血管生成和造血功能中也发挥重要作用。其中，Ephs在哺乳动物中形成了一个大的酪氨酸激酶家族，每个成员的基因敲除小鼠（KO）都表明Ephs在个体发育过程中发挥着多种作用。 EphB4 KO 及其配体 EphrinB2 KO 由于血管畸形而表现出胚胎致死性。 EphB4不仅在血管内皮细胞中表达，而且在红细胞的发育过程中也表达，并且在成红细胞的BFU-E中暂时观察到其表达。因此，我们利用漂浮细胞进行了研究，以研究EphB4在红细胞生成中的作用。 GM-CSF依赖性红白血病细胞系UT-7/GM内源性表达EphB4，以浓度依赖性方式粘附在EphrinB2包被的培养皿上，并且丝状伪足增加。此外，EphrinB2 还可增强纤连蛋白介导的粘附，并且不会像其他 Eph 成员报道的那样抑制粘附。此外，当 EphrinB2 在溶解状态下受到刺激时，也观察到这种增强纤连蛋白粘附的效果，表明细胞内部对细胞粘附的调节作用。因此，我们建立了野生型（EphB4wt）和各种突变形式的EphB4在IL3依赖性pro-B细胞系Ba/F3中稳定表达的细胞系，该细胞系不内源表达EphB4。表达 EphB4wt 的 Ba/F3 (EphB4wt/BF) 与 UT-7/GM 类似，以 EphrinB2 浓度依赖性方式粘附。在酪氨酸激酶活性失活的表达突变型EphB4的菌株(EphB4KD/BF)和胞内区域被删除的表达EphB4的菌株(EphB4dC/BF)中也观察到了这种粘附。此外，在所有 EphB4wt、EphB4KD 和 EphB4dC 中也观察到 EPhrinB2 依赖性粘附过程中丝状伪足的形成。因此，我们接下来研究EphB4引起的细胞内分子的变化。在UT-7/GM中，各种分子的酪氨酸磷酸化和c-Cbl磷酸化增加并且与CrkL相关。这种 EphrinB2 依赖性 CrkL 和 c-Cbl 结合也在 EphB4wt/BF 和 EphB4KD/BF 中观察到。上述结果表明，EphB4表现出EphrinB2依赖性粘附，并且该粘附不依赖于EphB4的细胞内区域。