破骨細胞の分化機構の解析とその制御

破骨细胞分化机制分析及其调控

基本信息

批准号：
01J00397
负责人：
宮本健史
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Keio University (2002-2003)Kumamoto University (2001)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J00397/
关键词：
破骨細胞マクロファージ樹状細胞サブトラクション

项目摘要

マクロファージとのDNAサブトラクション法により得られた破骨細胞に特異的に発現する分子の中から、特に破骨細胞に特異的もしくは破骨細胞分化に伴い発現が強く誘導される分子として5つの分子を同定した。これらの分子については全て全長cDNAのクローニングならびにエクソン/イントロン構造を決定し、またノザンブロット及びRT-PCRにて組織と血液細胞系列における発現を検討したところ、血液細胞系列においては破骨細胞に特異的であっても組織レベルでは骨以外の組織に発現を認めるものがあった。各分子の発現を破骨細胞分化のタイムコースを追ってみてみると、分化に伴い徐々に発現が強くなるものと、分化中期にピークがあり後期になるとむしろ発現が弱くなるものを認めた。それぞれの分子のC末端にGFPとのキメラ蛋白を作製し細胞内における局在を調べたところ、4分子は細胞質にまた1分子は核内に局在していた。これらの分子の機能評価をレトロウイルスによる過剰発現系で検討したところ、分化へは特に影響しないことが分かった。クローニングした分子はGeneBankに登録するとともに、以上の結果については現在進めているsiRNAを用いた抑制実験の結果と合わせて投稿準備中である。また、新規7回膜貫通型受容体に関してはノックアウトマウスを作製し、ホモ接合体の骨密度がリッターメイトに比べて約10%低下することを見出した。また発現制御機構についても解析をい、破骨細胞分化に重要とされるc-FosおよびNFATc1がこの分子の発現誘導に関与することを見出した。実際c-fosノックアウトマウス由来の脾細胞に破骨細胞分化誘導をかけても発現が誘導されず、レトロウイルスにてc-fosの発現をレスキューすると発現が回復することが観察された。これらの結果についても現在投稿準備中である。

在通过与巨噬细胞减法获得的破骨细胞中特异性表达的分子中，将五个分子鉴定为对破骨细胞特别特异性或与骨细胞分化相结合的强烈诱导的分子。所有这些分子都是克隆全长cDNA，并确定外显子/内含子结构，并通过Northern blot和RT-PCR检查组织和血细胞系中的表达。在血细胞系中，即使它们特定于破骨细胞，在组织水平上观察到骨骼以外的组织中的表达。当我们遵循破骨细胞分化的时间过程时，我们发现表达随分化而逐渐增加，并且在分化期间达到峰值，并在晚期降低。当在每个分子的C末端产生带有GFP的嵌合蛋白并细胞内检查定位时，将四个分子定位在细胞质中，一个分子位于核中。使用逆转录病毒过表达系统检查了这些分子的功能评估，发现对分化没有特别的影响。克隆分子将在Genebank注册，目前正在准备上述结果以及使用siRNA的当前抑制实验的结果提交结果。此外，为新的七个跨膜受体产生了基因敲除小鼠，并发现与Litermates相比，纯合物质的骨密度降低了约10％。还分析了表达控制机制，并发现对破骨细胞分化很重要的C-FOS和NFATC1参与诱导该分子的表达。实际上，观察到在源自C-FOS敲除小鼠的脾细胞上诱导破骨细胞分化，并且当用逆转录病毒救出C表达C-FOS表达时，该表达不会被诱导。这些结果目前正在准备提交。