超機能金属タンパク質の作製とセンシングおよび光エネルギー変換素子への応用

超功能金属蛋白的制备及其在传感和光能转换器件中的应用

• 批准号: 01J00398
• 负责人: 三重 安弘
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J00398/
• 关键词: 硝酸還元酵素; グラファイト"エッジ"電極; 回転電極; アンペロメトリックセンサー; ニトロフォリン; メディエーター分光電気化学; 酸化還元電位; シトクロムb562; 機能修飾電極; Superoxide dismutase (SOD); "逆"同位体効果; 再配列エネルギー; 光還元反応; NADPH; 薄層分光電気化学測定; マルチレドックス酵素

1.大腸菌の嫌気下での呼吸において誘導される硝酸還元酵素(触媒部位にMoイオンを持つ)を、パイロリティックグラファイトのエッジ電極を用いることで、電極表面上に活性を保持したまま安定に固定化することができた。この酵素固定化電極を回転電極法により解析したところ、酵素反応がMo^<5+>の時に活性が最大になることを見いだし、酵素反応機構解明のための大きな知見を得た。またこの電極が硝酸イオンのアンペロメトリックセンサーとして応用できることが示唆された。2.電極との直接電子移動制御が困難なCooAやニトロフォリンといったヘムタンパク質について、メディエーターを用いた分光電気化学法を用いることで、酸化還元電位を評価することができた。ヘムを利用したNO運搬機能を持つニトロフォリンは、同じヘム鉄イオン配位構造を持つミオグロビンなどに比べ200mV以上負な電位を示した。この機構を明らかにするため、ヘム近傍の荷電アミノ酸に変異を施した3種の変異体(D30N, D70N, K125Q)を作製し、電位評価を行ったところ、どの変異型も天然型をほぼ同じ電位を示したことから、ニトロフォリンの電位制御には、一つのアミノ酸が大きく寄与しているのではなく、ヘム周囲のアミノ酸三次構造全体で鉄イオンの電子密度を上げていると推察された。3.酸化還元電位が未知の金属タンパク質のメディエーター型分光電気化学測定において、従来の、一つ一つメディエーターを試行錯誤的に試す方法ではなく、異なる電位を持つメディエーターを多数用いた測定をまず行い、そこからおおよその電位を評価し、最適なメディエーターを絞っていくという方法が、非常に汎用性に優れた方法であることがわかり、比較的容易に天然および半人工型金属タンパク質の電位を評価できた(投稿準備中)。4.αヘリックスが4本バンドルした構造を持つヘムタンパク質、シトクロムb562、のバンドル部位に、システイン残基を施した変異分子を作製し、高純度なサンプルを得ることができた。この変異タンパク質は、(1)システイン残基により金属-硫黄結合で、金、銀、銅などの金属電極表面に容易に配向固定化が可能、(2)シトクロムb562は、酸化還元における再配列エネルギーが小さく電子移動制御が容易、(3)活性部位にNOガスなどの結合部位を作製することが可能、という特徴を持っており、新規なセンサー素子として期待できる。

1. 通过使用热解石墨边缘电极，大肠杆菌无氧呼吸过程中诱导的硝酸还原酶（催化位点上有Mo离子）可以稳定地固定在电极表面，同时保留其活性，我能够将其转化为硝酸盐还原酶。当使用旋转电极法分析该酶固定电极时，发现当Mo ^ 5+ 存在时酶反应的活性最大化，并且我们获得了阐明酶反应机理的重要知识。还建议该电极可用作硝酸根离子的电流传感器。 2. 我们能够通过使用介体的光谱电化学方法来评估血红素蛋白（例如 CooA 和硝基蛋白）的氧化还原电位，这些蛋白很难用电极直接控制电子转移。与具有相同血红素铁离子配位结构的肌红蛋白相比，具有利用血红素输送NO的功能的硝基钙蛋白表现出超过200mV的负电位。为了阐明该机制，我们创建了三个突变体（D30N、D70N、K125Q），其中血红素附近的带电氨基酸发生了突变，并评估了电位，从显示的结果推断，硝基磷酸蛋白的电位控制。不是由单一氨基酸引起的，而是血红素周围的整个氨基酸三级结构增加了铁离子的电子密度。 3.在氧化还原电位未知的金属蛋白的介体型光谱电化学测量中，我们首先使用大量具有不同电位的介体进行测量，而不是传统的逐一测试介体的试错方法。从那里评估近似潜力并缩小最佳介体范围的方法是一种极其通用的方法，并且评估天然和半人工金属蛋白的潜力相对容易（准备发布）。 4.我们创建了一种突变分子，其中在细胞色素b562（一种具有四束α螺旋结构的血红素蛋白）的束位点添加了半胱氨酸残基，并能够获得高纯度的样品。这种突变蛋白（1）由于半胱氨酸残基，可以很容易地通过金属硫键定向并固定在金、银、铜等金属电极表面；（2）细胞色素B562具有发生能力。其具有以下特点：(3)可以在活性位点中创建NO气体等的结合位点，有望用作新型传感器元件。

项目成果

MIE, Yasuhiro: "Functional Evaluation of Heme Vinyl Groups in Myoglobin with symmetric Protoheme Isomers"Biochemistry. 発表予定.

MIE，Yasuhiro：“用对称原血红素异构体对肌红蛋白中血红素乙烯基进行功能评估”生物化学。

TANIGUCHI, Isao: "Analysis of Biological Functions of Metalloproteins Using Biocompatible Modified Electrodes"Anal. Sci.. 17. 1355-1358 (2001)

TANIGUCHI, Isao：“使用生物相容性修饰电极分析金属蛋白的生物学功能”分析。