直接電気化学法を用いたCYPのハイスループット薬物代謝活性計測ツールの開発

直接电化学法高通量CYP药物代谢活性测定工具的开发

• 批准号: 18790036
• 负责人: 三重 安弘
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790036/
• 关键词: シトクロムP450(CYP); 一塩基多型; 薬物代謝活性; 膜結合蛋白; 配向固定; 電気化学活性計測; 薄膜コーティング; 直接電子移動; CYP; 電極界面; 電子移動; 薬物代謝; ポリイオン薄膜

本年度は,まず昨年度に見出したポリイオン膜を用いる手法により,CYP2C9の固定化を行い電気化学的な薬物代謝活性計測を検討した。代表的な薬物であるジクロフェナックについてミカエリス・メンテン型の電流応答(酵素反応応答)が得られ,kmとして18μMが見積もられた。これは,従来法で得られている値(3-52μM)とよく一致した。しかしながら,このポリイオン膜を用いる手法ではイオン強度等の条件によりCYP酵素が容易に電極界面から剥がれ,計測に対する安定性が不十分であることが明らかになった。そこで新たな固定化法の鋭意検討を行った結果,電極界面に凹凸を持たせ疎水性の超薄膜(〈5nm)でコーティングするとその界面上にCYP酵素が安定に固定化されることを発見した。CYP酵素は膜結合型の蛋白質であり疎水性の膜結合部位と疎水性の電極界面との相互作用が主要な固定化力として働いていると予想された。4℃の緩衝溶液中において1ヶ月以上の保存が可能であった。また,この方法では従来法よりも迅速な電極-CYP酵素間の電子移動を生じさせる事ができ(現在までに報告されているヒトCYPの電子移動速度定数の3-100倍程度),これにより従来法では困難であったCYP酵素の酸化還元物性評価,すなわち酵素反応特性の重要な因子である酸化還元電位に及ぼす基質薬物結合やpH等の影響を明瞭かつ迅速に調べることも可能となった(投稿論文準備中)。更に,アルゴン通気条件下ではCYP2C9についてその主要な代謝薬物であるジクロフェナックやトルブタミドに対して適切なkm値を見積れることも確認され,安価な電極を利用したCYPの酵素反応評価を簡便な電気化学計測で行えることが示された。固定化電極の高感度反射FTIR測定からは,CYP分子が電極界面で配向固定されていることも示唆されている。電極一酵素間の迅速な電子移動および溶媒中の基質との代謝反応の両方をスムースに進行させるにはこの配向固定化が重要であると考えられた。この系を簡易的なフローシステムに適用し定電位電解計測を行ったところ,基質薬物濃度に応じた電流応答も得られた。

今年，我们首先使用去年发现的聚离子膜方法固定CYP2C9，并研究了药物代谢活性的电化学测量。对于代表药物双氯芬酸获得米氏型电流响应（酶反应响应），并且km估计为18μM。这与传统方法（3-52 μM）获得的值非常吻合。然而，在使用聚离子膜的该方法中，由于离子强度等条件，CYP酶容易从电极界面剥离，并且可知测量稳定性不足。通过对新固定方法的深入研究，我们发现，如果电极界面不平坦并涂有疏水性超薄膜（<5 nm），CYP酶可以稳定地固定在界面上。 CYP酶是一种膜结合蛋白，疏水膜结合位点与疏水电极界面之间的相互作用预计将充当主要的固定力。在4℃缓冲液中可保存1个月以上。此外，该方法允许电极和CYP酶之间的电子转移比传统方法更快（大约是迄今为止报道的人类CYP的电子转移速率常数的3-100倍），因此可以评估CYP的氧化还原物理性质； CYP酶，换句话说，要清晰、快速地研究底物药物结合、pH等对氧化还原电位的影响，氧化还原电位是酶反应特性的重要因素（准备提交论文。 ）。此外，证实在氩气通气条件下，可以估计CYP2C9的主要代谢物双氯芬酸和甲苯磺丁脲的适当km值，并且发现使用廉价电极的CYP酶反应评估可以使用电化学轻松评估事实证明这可以通过测量来完成。固定电极的高灵敏度反射 FTIR 测量也表明 CYP 分子的方向在电极界面处是固定的。这种方向固定被认为对于电极和酶之间的快速电子转移以及与溶剂中的底物的平稳代谢反应非常重要。当将该系统应用于简单的流动系统并进行恒电位电解测量时，还获得了取决于底物药物浓度的电流响应。

项目成果

CYP2C9の電極上への固定化と電気化学的薬物代謝活性評価

CYP2C9在电极上的固定化及药物代谢活性的电化学评价

• 发表时间: 2007
• 作者: 桝飛雄真;片桐幸輔;加藤貴子;富永昌英;影近弘之;東屋功;R. Ikeda;三重 安弘
• 通讯作者: 三重 安弘

電極を用いたシトクロムP450(CYP)の簡便活性計瀾の検討

简易电极式细胞色素P450（CYP）活性仪的研究

• 发表时间: 2007
• 作者: 桝飛雄真;片桐幸輔;加藤貴子;富永昌英;影近弘之;東屋功;R. Ikeda;三重 安弘;三重 安弘
• 通讯作者: 三重 安弘