カルシウム感受性のあるミオシン分子のモーター・ドメインの機能と構造

钙敏感肌球蛋白分子运动域的功能和结构

基本信息

批准号：
01J00010
负责人：
川道穂津美
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

ミオシン(従来型ミオシンII)は、代表的なモーター蛋白質であり、ATPの分解による化学エネルギーを運動という機械的エネルギーに変換する機能を持っている。その構造と機能の解明には、発現蛋白質として得ることが不可欠と考えられる。ミオシンの制御には、リン酸化によるタイプとCa^<2+>を結合するタイプに分かれるが、本研究で取り扱う真正粘菌フィザルム・ミオシンは後者に相当するが、このタイプのミオシンの発現蛋白質化は成功例がない。本年は、フィザルム・ミオシンHMMを3種類のバキュロウイルス(重鎖のHMM領域を発現するウイルス、必須軽鎖を発現するウイルス、制御軽鎖を発現するウイルス)を用い、昆虫細胞Sf-9で複合体蛋白質として共発現させた。発現したHMMを精製し、ATPase活性を測定し、そのATPase活性はアクチン存在下で活性化されることを検出することができた。また、制御軽鎖のリン酸化によりATPase活性が増加することを検出した。in vitro motility assayによる運動測定では、Ca^<2+>によるモーター活性の抑制と制御軽鎖のリン酸化によるモーター活性の活性化を検出した。さらに、Ca^<2+>を結合しない変異必須軽鎖ウイルスを作成し、mutant HMMを発現させ、この機能解析により、カルシウム感受性を欠いたHMMの発現に成功したことが確かめられた。また、HMMの大量発現と精製法の改良も行い、X線結晶解析のための結晶化の準備が整った。以上、カルシウム感受性のあるミオシン分子モーターの機能解析がさらに前進し、X線結晶解析への途も開かれた。

肌球蛋白（常规肌球蛋白II）是一种典型的运动蛋白，其功能是将ATP分解为机械能引起的化学能转化为称为动力学的机械能。人们认为，将其作为表达蛋白质获取对于阐明其结构和功能至关重要。肌球蛋白的调节被分为磷酸化类型，结合了Ca^<2+>，但是本研究中覆盖的春季粘液霉菌纤维菌素的后一种类型与后者相对应，但没有成功表达这种类型肌球蛋白的蛋白质化的病例。今年，使用三种类型的杆状病毒（表达重链的HMM区域，表达必需轻链的病毒和表达受控轻链的病毒），fizarum肌球蛋白HMM在昆虫细胞中被共表达为一种复杂的蛋白质SF-9。纯化表达的HMM，测量ATPase活性，并可以检测到在肌动蛋白存在下激活ATPase活性。此外，检测到受控轻链的磷酸化增加了ATPase活性。使用体外运动测定法检测到通过CA^<2+>检测到运动活性的运动测量，并通过受控轻链的磷酸化激活运动活性。此外，创建了不结合Ca^<2+>的突变基本的轻链病毒，并表达了突变的HMM，并且该功能分析证实，它成功地表达了缺乏钙敏感性的HMM。此外，已经采用了大量的HMM表达和改进的纯化方法，并完成了X射线晶体学结晶的准备。这导致了对钙敏感肌球蛋白分子电动机的功能分析进一步的进步，X射线晶体学的路径也已打开。