カルシウム感受性のあるミオシン分子のモーター・ドメインの機能と構造

钙敏感肌球蛋白分子运动域的功能和结构

基本信息

批准号：
01J00010
负责人：
川道穂津美
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

ミオシン(従来型ミオシンII)は、代表的なモーター蛋白質であり、ATPの分解による化学エネルギーを運動という機械的エネルギーに変換する機能を持っている。その構造と機能の解明には、発現蛋白質として得ることが不可欠と考えられる。ミオシンの制御には、リン酸化によるタイプとCa^<2+>を結合するタイプに分かれるが、本研究で取り扱う真正粘菌フィザルム・ミオシンは後者に相当するが、このタイプのミオシンの発現蛋白質化は成功例がない。本年は、フィザルム・ミオシンHMMを3種類のバキュロウイルス(重鎖のHMM領域を発現するウイルス、必須軽鎖を発現するウイルス、制御軽鎖を発現するウイルス)を用い、昆虫細胞Sf-9で複合体蛋白質として共発現させた。発現したHMMを精製し、ATPase活性を測定し、そのATPase活性はアクチン存在下で活性化されることを検出することができた。また、制御軽鎖のリン酸化によりATPase活性が増加することを検出した。in vitro motility assayによる運動測定では、Ca^<2+>によるモーター活性の抑制と制御軽鎖のリン酸化によるモーター活性の活性化を検出した。さらに、Ca^<2+>を結合しない変異必須軽鎖ウイルスを作成し、mutant HMMを発現させ、この機能解析により、カルシウム感受性を欠いたHMMの発現に成功したことが確かめられた。また、HMMの大量発現と精製法の改良も行い、X線結晶解析のための結晶化の準備が整った。以上、カルシウム感受性のあるミオシン分子モーターの機能解析がさらに前進し、X線結晶解析への途も開かれた。

肌球蛋白（常规肌球蛋白II）是一种典型的运动蛋白，具有将ATP分解产生的化学能转化为运动形式的机械能的功能。为了阐明其结构和功能，获得其表达蛋白被认为是至关重要的。肌球蛋白调节有两种类型：磷酸化型和Ca^<2+>-结合型，本研究中处理的真粘菌泡浆肌球蛋白对应于后者，但这种类型的肌球蛋白是通过蛋白质表达来表达的。没有成功案例。今年，我们在昆虫细胞 Sf-9 中使用了三种杆状病毒（表达重链 HMM 区域的病毒、表达必需轻链的病毒和表达调节轻链的病毒）。共表达为复杂蛋白质。我们纯化了表达的 HMM 并测量了其 ATPase 活性，并且能够检测到 ATPase 活性在肌动蛋白存在下被激活。我们还检测到由于调节轻链的磷酸化，ATP酶活性增加。使用体外运动测定的运动测量检测了Ca 2+ 对运动活性的抑制以及通过调节轻链的磷酸化对运动活性的激活。此外，我们创建了不结合Ca ^ 2+ 的突变必需轻链病毒并表达突变HMM，并且通过功能分析，我们确认我们已成功表达缺乏钙敏感性的HMM。我们还改进了 HMM 的质量表达和纯化方法，现在准备将其结晶用于 X 射线晶体学。如上所述，钙敏感肌球蛋白分子马达的功能分析取得了进一步进展，为X射线晶体学铺平了道路。