血管平滑筋の異常収縮シグナル伝達の可視化による解明と創薬スクリーニング

通过血管平滑肌异常收缩信号传输的可视化进行阐明和药物发现筛选

基本信息

批准号：
18700391
负责人：
川道穂津美
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

蛋白発現・精製法、アクチンフィラメント-ミオシンの滑り速度測定法(in vitro motility assay)などの分子・細胞生物学的手法を駆使して、血管異常収縮(=Ca^<2+>非依存性のアクチンフィラメント-ミオシン滑り速度の増加)におけるシグナル分子の役割をリアルタイム可視化解析により検討した。具体的な実績は以下の通りである。(1)リコンビナント蛋白発現系(バキュロウイルス-昆虫細胞Sf9)を用いて、非常に困難とされているリコンビナント平滑筋ミオシンを活性のある形で発現、精製した。(2)血管の異常収縮のシグナル伝達系の鍵を握る分子であるROKでミオシンをリン酸化することに成功した。リン酸化は、SDS-PAGE電気泳動とProQ Diamond染色で確認した。(3)ROKでリン酸化された上記のミオシフンを用いて、ミオシンとアクチンとの滑り運動(=血管の異常収縮)をカルシウム非存在化で、リアルタイム可視化解析することに成功し、その速度解析を行った。この滑り運動が起きたことは、スキンド血管組織でカルシウム非存在化でのROKタンパク質投与時の収縮結果(JBC, 1997)を純粋なin vitro の系でも再現できたことを意味する。また、滑り運動速度はカルシウム依存性の正常収縮時の滑り運動速度とほぼ同じであった。これらの成果は、日本生物物理学会(2007年3月)、日本生理学会(2008年3月)で学会発表し、非常に高い評価を得た。よって、本研究課題は、順調に遂行された。なお、本研究は、山口大学組換えDNA実験安全委員会の承認および山口大学動物実験規則に基づく動物実験委員会の承認を得ている。

我们利用分子和细胞生物学方法如蛋白质表达和纯化方法以及肌动蛋白丝-肌球蛋白滑动速度测量方法（体外运动测定）来研究异常血管收缩（=Ca^<2+>-独立）信号的作用。使用实时可视化分析研究了肌动蛋白丝-肌球蛋白滑动速度增加中的分子。具体成果如下。 (1)利用重组蛋白表达系统（杆状病毒-昆虫细胞Sf9），以活性形式表达并纯化重组平滑肌肌球蛋白，这被认为是极其困难的。 (2)我们成功地用ROK磷酸化肌球蛋白，肌球蛋白是异常血管收缩信号转导系统中的关键分子。通过 SDS-PAGE 电泳和 ProQ Diamond 染色证实磷酸化。 (3)使用上述ROK-磷酸化myosyfun，我们成功地实时视觉分析了无钙条件下肌球蛋白和肌动蛋白之间的滑动运动（=血管异常收缩），并分析了其速度。这种滑动运动的发生意味着在皮肤血管组织中缺乏钙的情况下施用ROK蛋白时获得的收缩结果（JBC，1997）可以在纯体外系统中重现。此外，滑动速度与正常钙依赖性收缩时几乎相同。这些结果在日本生物物理学会（2007年3月）和日本生理学会（2008年3月）上发表，并获得了高度评价。因此，本研究项目进展顺利。本研究已根据山口大学动物实验规则获得山口大学重组DNA实验安全委员会和动物实验委员会的批准。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

The involvement of cholesterol and membrane rafts in the signaltransduction of abnormal vascular smooth muscle contraction.

胆固醇和膜筏参与异常血管平滑肌收缩的信号转导。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
F.Guo;et al.;小林誠;C.wang;C.wang;H. Kawamichi;S. Kobayashi;H. Kishi;D. Xu;K. Kajiya;郭鳳玲;加治屋勝子;川道徳津美;H. Kawamichi;小林誠;岸博子;Hiroko Kishi
通讯作者：
Hiroko Kishi

血管平滑筋のカルシウム非依存性収縮におけるFynテロシンキナーゼの重要性

Fyn 酪氨酸激酶在血管平滑肌钙依赖性收缩中的重要性