ナトリウムイオン駆動型回転モーター特異的蛋白質MotXとMotYの機能解析

钠离子驱动的旋转电机特异性蛋白 MotX 和 MotY 的功能分析

• 批准号: 12878122
• 负责人: 本間 道夫
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12878122/
• 关键词: イオンチャネル; エネルギー変換; ビブリオ菌; べん毛; モーター; ナトリウム駆動力

昨年度は、海洋性ビブリオ菌においてmotXのクローン化を行い、motXとmotY遺伝子から発現させた蛋白質が、相互作用することを示した。また、モーター蛋白質としてMotXの方が機能に必須である可能性も示唆した。今年度は、まず、この結果をまとめるために、データを取り直し、論文として発表した。続いて、MotXが大腸菌に及ぼす影響について、大腸菌でV. alginolyticusのMotXを発現させて調査したところ、その発現量に伴って大腸菌の生育が抑制されることが分かった。また、生育抑制のみならず、生菌数の減少が認められた為、Na^+チャネル阻害剤であるアミロライドによって、この大腸菌の致死性が緩和されるかどうかを検討した。アミロライド存在下では、大腸菌の生育自身が大幅に抑制されMotXの発現量も低下した。このため、アミロライドの効果を特定することは困難であり、MotXがNa^+チャネルとして働くという他の研究グループの結果を考え直す必要性を示唆した。続いて、PomAの最もN末端側の推定膜貫通領域を含む部分と、MotXまたはMotYにおけるN末端側推定膜貫通領域を除くC末領域をつなげて、AXキメラ、AYキメラと名付けた融合タンパク質を作製した。作製したAXキメラ、AYキメラの機能は、野生型MotX、MotYと比べると無視できる程度で効果的とはいえず、AXキメラの発現は、大腸菌の生育には影響なかった。加えて、AXキメラ、AYキメラともに膜画分に存在することを明らかにした。また、MotX、AXキメラともに6M尿素によって可溶化できることを確認した。この結果から、AXキメラはMotXの性質をある程度保有していると推測された。一方、MotXは内膜でも外膜でもないところに存在しているようであったのに対して、AXキメラは完全に内膜に存在しているようであった。これらを総合して、AXキメラ、AYキメラは、機能に直接関係し、その性質を反映する部分を持つものの、正しく局在するために必要な部分を持っておらず、本来局在すべき場所に局在できないために機能を発揮できなくなったと推論した。

去年，将MOTX克隆在海洋弧菌细菌中，表明从Motx和Moty基因相互作用的蛋白质相互作用。它还表明，Motx对于其作为运动蛋白的功能可能更为必不可少。今年，我们首先重新录制了数据，并将其作为论文发布，以总结这些结果。接下来，当我们通过在大肠杆菌中表达静脉内分析的MOTX来研究Motx对大肠杆菌的影响时，发现由于表达的量，大肠杆菌的生长被抑制了大肠杆菌的生长。此外，由于不仅抑制生长，而且观察到活细菌数量的减少，我们研究了Na^+通道抑制剂Amiloride是否减轻了大肠杆菌的致死性。在Amiloride的存在下，大肠杆菌生长本身受到了显着抑制，MOTX表达水平也降低了。这使得很难确定阿米洛德的影响，这表明需要重新考虑其他研究小组的结果，即Motx充当Na^+通道。接下来，除了Motx或Moty的N末端推定的跨膜区域外，含有POMA的最N末端推定的跨膜区域的部分与C末端区域相连，以创建一个名为AX Chimeras和Ay Chimeras的融合蛋白。与野生型Motx和Moty相比，产生的AX和AY嵌合体的功能可以忽略不计，并且无效，并且Ax Chimeras的表达对大肠杆菌的生长没有影响。此外，据揭示了膜分数中都存在AX和AY嵌合体。还可以证实，Motx和Ax Chimera都可以用6M尿素溶解。从这些结果中可以推测AX Chimera具有Motx的某些特性。另一方面，MOTX似乎存在于内膜和外膜中，而轴嵌合体似乎完全存在于内膜中。通过将它们结合起来，我们推断出，尽管AX和AY嵌合体与功能直接相关并反映其特性，但它们没有适当定位所需的零件，并且无法本地化到最初应该定位的位置，因此他们无法执行其功能。

项目成果

Okabe, M., Yakushi, T., Asai, Y., Homma, M.: "Cloning and characterization of motX, a Vibrio alginolyticus sodium-driven flagellar motor gene"J. Biochem.. 130(6). 879-884 (2001)

Okabe, M.、Yakushi, T.、Asai, Y.、Homma, M.：“溶藻弧菌钠驱动鞭​​毛运动基因 motX 的克隆和表征”J.

Yorimitsu,T.,and M.Homma.: "Na^+-driven flagellar motor of Vibrio."Biochem.Biophys.Acta-Bioenergetics. (in press). (2001)

Yorimitsu,T. 和 M.Homma.：“Na^ 驱动的弧菌鞭毛马达。”Biochem.Biophys.Acta-Bioenergetics。