ナトリウムイオン駆動型回転モーターの機能解析

钠离子驱动旋转电机的功能分析

• 批准号: 09279219
• 负责人: 本間 道夫
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09279219/
• 关键词: イオンチャネル; システイン置換; ビブリオ菌; べん毛; モーター

最近、Na^+駆動型モーターのエネルギー変換ユニットあるいはイオンチャネルに対応すると考えられる遺伝子(motX、motY、pomA、pomB)が同定された。MotX、MotYタンパク質は共に1回膜貫通タンパク質で、特にMotXは、Na^+チャネルであると提唱されている。PomAタンパク質は4つの推定膜貫通領域を持ち、大腸菌のMotAにおいてイオンの透過に重要であると考えられているアミノ酸がよく保存されていた。このことから、PomAはモーター中でNa^+チャネルとして機能している可能性が考えられた。そこで、PomAの細胞外ループ領域について、システイン置換法により解析をおこなった。21番目のバリンから34番目のセリンまでをloop1-2領域(1本目と2本目の膜貫通領域の間)と考え、すべてについてシステイン置換体を作成した。これらのうち、G24C変異体だけが、システインに置換しただけで運動能を失い、D31C変異体は運動能が低下した。この2変異体を含むすべてについて、チオール基特異的化学修飾剤であるDTNBを作用させたところ、G23C、S25C、D31C、S34Cの4変異体が軟寒天培地上での運動を阻害された。またloop3-4領域では、167番目のセリンから171番目のグルタミン酸までの5変異体を作成した。これらのうち、システインに置換しただけで運動能を失うものはなく、M169C、D170C、D171Cの3変異体が修飾剤の付加により、運動能が低下した。さらに、細胞内ループ領域の負電荷を持つ3つのアミノ酸と、4本目の膜貫通領域中のスレオニンについてもシステイン置換をおこなった。次に、細胞外ループの3変異体(G23C、M169C、D170C)と細胞内ループの3変異体(D71C、D148C、D202C)について、DTNBとNEMの2種類の修飾剤を用いて、直接遊泳速度を測定し、阻害効果を調べた。膜を通過しないと考えられているDTNBは、細胞外の3変異体のみ遊泳速度を低下させた。

最近，已经鉴定出与Na^+驱动电动机的能量转换单元或离子通道相对应的基因（Motx，Moty，Poma，Pomb）。 Motx和Moty蛋白都是单个跨膜蛋白，尤其是MOTX是Na^+通道。 POMA蛋白具有四个假定的跨膜区域，并且氨基酸被认为对大肠杆菌中MOTA的离子渗透很重要。这表明POMA可能在电动机中充当Na^+通道。因此，通过半胱氨酸替代方法分析了POMA的细胞外环区。从第21位的Valine到第34位丝氨酸，我们考虑了环路1-2区域（在第一和第二跨膜区域之间），并为所有人创建了半胱氨酸取代。其中，仅当用半胱氨酸代替时，只有G24C突变体损失运动，而D31C突变体降低了运动。所有这两个突变体都用硫醇组特异性化学修饰剂DTNB和四个突变体G23C，S25C，D31C和S34C进行了作用，在软琼脂培养基上抑制了运动。此外，在LOOP3-4区域中创建了五个突变体，从167的丝氨酸到位置171处的谷氨酸。这些突变体仅通过替换半胱氨酸而失去运动性，而三个突变体M169C，D170C和D171C由于添加了改良剂而降低了运动能力。此外，还针对细胞内环区域中的三个负电荷氨基酸和第四跨膜区域的苏氨酸进行半胱氨酸取代。接下来，使用两个修饰符DTNB和NEM直接测量了细胞外环（G23C，M169C，D170C）和三个突变体（D71C，D148C，D202C）的三个突变体。被认为不穿过膜的DTNB只有三个细胞外突变体降低了其游泳速度。

项目成果

Asai,Y.: "Putative channel components for the very fast rotating sodium driven flagellar motor." J.Bacteriol.179. 5104-5110 (1997)

Asai，Y.：“用于非常快速旋转的钠驱动鞭毛马达的假定通道组件。”