水素ガス産生用ウエルシュ菌バイオリアクター開発のための基礎研究

产气荚膜梭菌产氢气生物反应器开发的基础研究

• 批准号: 12877048
• 负责人: 岡部 昭延
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kagawa Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877048/
• 关键词: ウェルシュ菌; Clostridium perfringens; 水素ガス; ガス産生; ヒドロゲナーゼ; フェレドキシン; 酪酸; 遺伝子投与; バイオリアクター; pyruvate:ferredoxin酸化還元酵素

ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)を用いた水素ガス産生用バイオリアクター開発のための基礎研究として、培養条件とヒドロゲナーゼ関連の遺伝子改変の影響について検討した。C. perfringens NCTC8237株をTYG培地で培養し、水素ガス産生に対する培地のpHの影響を調べた。pHを調整しない場合、増殖とともにpHは低下し、水素ガスは60%であるのに対し、pHを7.4に維持した場合、90%に改善された。ガス成分比では大きく改善されたが、水素ガス量は改善されなかった。pH未調整の場合も、培養の初期においては水素ガスの成分比は高く、培養が進むにしたがって低下した。C. perfringens strain 13からクローニングしたビドロゲナーゼ遺伝子(hydA)をpJIR418をベクターとして遺伝子投与し、水素ガス産生性を調べた。ガス成分比、水素ガスの産生量において、非投与菌との間に有意な差は見られなかった。hydAの発現量は増加していることから、ヒドロゲナーゼの活性が水素ガス産生の律速ではないことが明らかとなった。本菌の主要な発酵経路である酢酸発酵、酪酸発酵はヒドロゲナーゼへの電子の供給と競合すると考えられるが、上記のpH調製時の場合と同様、遺伝子投与の場合もこれら発酵産物の産生は影響を受けなかった。hydA遺伝子の下流に位置するbutylate kinase(buk)の遺伝子破壊により酪酸発酵への電子の供給を遮断することを試みた。しかし変異菌は得られず、本遺伝子は必須と考えられた。ヒドロゲナーゼに電子を供給するフェレドキシン(Fdx)の菌体内の濃度を高めることにより、水素ガスの産生が増加することを期待し、すでに決定されたゲノムの塩基配列を基に、fdx遺伝子のクローニングを行った。本遺伝子には独特のベント構造と鉄制御に関係する配列を有していることが明らかとなった。本遺伝子の投与と鉄添加により水素ガス産生能の改善の可能性が示唆された。

作为开发利用产气荚膜梭菌生产氢气的生物反应器的基础研究，我们研究了培养条件和氢化酶相关基因修饰的影响。将产气荚膜梭菌NCTC8237菌株在TYG培养基中培养，考察培养基pH值对产氢的影响。当不调节pH值时，pH值随着生长而下降，用氢气使pH值下降60%，而当pH值维持在7.4时，pH值提高至90%。虽然气体成分比大大提高，但氢气的量并没有提高。即使在不调节pH的情况下，氢气的成分比在培养开始时也较高，并且随着培养的进行而降低。使用pJIR418作为载体施用从产气荚膜梭菌菌株13克隆的氢化酶基因(hydA)，并研究氢气的产生。细菌与未处理细菌之间的气体成分比例和产生的氢气量没有观察到显着差异。由于 hydA 的表达水平增加，很明显氢化酶活性并不是氢气产生的速率限制。乙酸发酵和丁酸发酵是该细菌的主要发酵途径，被认为与氢化酶的电子供应竞争，但与上述pH调节的情况一样，这些发酵产物的生产也受到影响我没有收到基因管理。我们试图通过破坏位于 hydA 基因下游的丁酸激酶 (buk) 基因来阻断丁酸发酵的电子供应。然而，没有获得突变细菌，并且该基因被认为是必需的。我们希望通过增加细胞内向氢化酶提供电子的铁氧还蛋白（Fdx）浓度来增加氢气的产量，并根据已确定的基因组核苷酸序列克隆了fd​​x基因。研究表明，该基因具有独特的排气口结构和与铁调节相关的序列。有人建议施用该基因和添加铁可以提高氢气产生能力。

项目成果

Miyata,S.: "Cleavage of a C-terminal peptide is essential for heptamerization of Clostridium perfringens epsilon-toxin in the synaptosomal membrane."J.Biol.Chem.. (in press). (2001)

Miyata,S.：“C 端肽的切割对于突触体膜中产气荚膜梭菌ε-毒素的七聚化至关重要。”J.Biol.Chem..（出版中）。