特殊ベント・プロモーターを利用した新規高発現ベクターの構築

使用特殊弯曲启动子构建新的高表达载体

• 批准号: 14657069
• 负责人: 岡部 昭延
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657069/
• 关键词: Clostridium perfringerns; ウエルシュ菌; クロストリジウム; 発現ベクター; フェレドキシン; ベントDNA; シアリダーゼ; コラゲナーゼ; Clostridium perfringens; Ferredoxin gene; Expression vector; Sialidase; Collagenase; Transcriptional fusion; Phased A-tracts; Curved DNA

ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)のフェレドキシン遺伝子のプロモーターの上流域からプロモーター内部にかけて存在する5つの連続するPhased A-tractsは、新しいタイプのBent DNAであり、その折れ曲がり角度は110°と強い。上流3つのA-tractsと下流2つのA-tractsの相乗作用によりフェレドキシンのプロモーターを活性化することを明らかにした。この特殊なベント・プロモーターをC.perfringens/Escherichia coliのシャトル・ベクター兼プロモーター選択ベクターであるpPSVにクローン化し、高発現ベクターpFFを構築した。C.perfringens/pFF系の有用性を調べるために、C.perfringensの75kDaのシアリダーゼ(NanI)の構造遺伝子とpFFをTranscriptional fusionし、pFFNを構築した。対照として、nanI遺伝子の全領域を組み込んだベクターpPSVNを構築した。さらにAT-rich遺伝子の高発現系として開発されたE.coli BL21(DE3)CodonPlus-RILにおけるNanI産生能と比較するために、pUC19にnanIをクローン化した。C.perfringes/pFFNは、C.perfringens/pPSVNの60倍、大腸菌系の約15倍の産生を示した。培養液100mlから2段階精製法で約3mgの高純度のNanIが精製された。以上のことから、C.perfringens/pFF系はシアリダーゼの高発現系に有用であることが明らかとなった。pFFの有用性について、120kDaのコラゲナーゼ遺伝子についても同様に検討したところ、発現量の改善は見られたが、C.perfringens菌そのものを培養した時と同様に、分解産物も認められた。コラゲナーゼ産生のためには、今後Protease欠損の変異株の利用や培養条件などについて検討する必要があることが明らかとなった。

从产气荚膜梭菌铁氧还蛋白基因启动子上游区域到启动子内部存在的五个连续的Phased A-tracts是一种新型的Bent DNA，具有110°的强弯曲角度。我们发现铁氧还蛋白启动子是由三个上游 A 束和两个下游 A 束的协同作用激活的。将这种特殊的弯曲启动子克隆到产气荚膜梭菌/大肠杆菌的穿梭载体和启动子选择载体pPSV中，构建高表达载体pFF。为了研究产气荚膜梭菌/pFF系统的有用性，通过将产气荚膜梭菌75kDa唾液酸酶(NanI)结构基因和pFF转录融合来构建pFFN。作为对照，构建了掺入nanI基因的整个区域的载体pPSVN。此外，将nanI克隆到pUC19中，以比较大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus-RIL中NanI的生产能力，该大肠杆菌被开发为富含AT基因的高表达系统。产气荚膜梭菌/pFFN的产量比产气荚膜梭菌/pPSVN高60倍，比大肠杆菌系统高约15倍。采用两步纯化法从100ml培养液中纯化出约3mg的高纯度NanI。由上可知，产气荚膜梭菌/pFF系统作为唾液酸酶的高表达系统是有用的。关于pFF的有用性，当我们类似地检查120kDa胶原酶基因时，观察到表达水平的提高，但也观察到降解产物，就像培养产气荚膜梭菌本身时一样。为了生产胶原酶，未来有必要考虑蛋白酶缺陷突变株的使用和培养条件。

项目成果

Masato Kaji: "A novel type of DNA curvature present in a Clostridium perfringens ferredoxin gene : characterization and role in gene expression."Microbiology. 149・11. 3083-3091 (2003)

Masato Kaji：“产气荚膜梭菌铁氧还蛋白基因中存在的新型 DNA 弯曲：基因表达中的特征和作用。”微生物学 149・11 3083-3091（2003）。

Akihisa Takamizawa: "High-level expression of clostridiial sialidase using a ferredoxin gene promoter-based plasmid."Protein Expression and Purification. in press. (2004)

Akihisa Takamizawa：“使用基于铁氧还蛋白基因启动子的质粒高水平表达梭菌唾液酸酶。”蛋白质表达和纯化。