特殊ベント・プロモーターを利用した新規高発現ベクターの構築

使用特殊弯曲启动子构建新的高表达载体

• 批准号: 14657069
• 负责人: 岡部 昭延
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657069/
• 关键词: Clostridium perfringerns; ウエルシュ菌; クロストリジウム; 発現ベクター; フェレドキシン; ベントDNA; シアリダーゼ; コラゲナーゼ; Clostridium perfringens; Ferredoxin gene; Expression vector; Sialidase; Collagenase; Transcriptional fusion; Phased A-tracts; Curved DNA; Clostridium perfringerns; ウエルシュ菌; クロストリジウム; 発現ベクター; フェレドキシン; ベントDNA; シアリダーゼ; コラゲナーゼ; Clostridium perfringens; Ferredoxin gene; Expression vector; Sialidase; Collagenase; Transcriptional fusion; Phased A-tracts; Curved DNA

ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)のフェレドキシン遺伝子のプロモーターの上流域からプロモーター内部にかけて存在する5つの連続するPhased A-tractsは、新しいタイプのBent DNAであり、その折れ曲がり角度は110°と強い。上流3つのA-tractsと下流2つのA-tractsの相乗作用によりフェレドキシンのプロモーターを活性化することを明らかにした。この特殊なベント・プロモーターをC.perfringens/Escherichia coliのシャトル・ベクター兼プロモーター選択ベクターであるpPSVにクローン化し、高発現ベクターpFFを構築した。C.perfringens/pFF系の有用性を調べるために、C.perfringensの75kDaのシアリダーゼ(NanI)の構造遺伝子とpFFをTranscriptional fusionし、pFFNを構築した。対照として、nanI遺伝子の全領域を組み込んだベクターpPSVNを構築した。さらにAT-rich遺伝子の高発現系として開発されたE.coli BL21(DE3)CodonPlus-RILにおけるNanI産生能と比較するために、pUC19にnanIをクローン化した。C.perfringes/pFFNは、C.perfringens/pPSVNの60倍、大腸菌系の約15倍の産生を示した。培養液100mlから2段階精製法で約3mgの高純度のNanIが精製された。以上のことから、C.perfringens/pFF系はシアリダーゼの高発現系に有用であることが明らかとなった。pFFの有用性について、120kDaのコラゲナーゼ遺伝子についても同様に検討したところ、発現量の改善は見られたが、C.perfringens菌そのものを培養した時と同様に、分解産物も認められた。コラゲナーゼ産生のためには、今後Protease欠損の変異株の利用や培養条件などについて検討する必要があることが明らかとなった。

五个连续的分阶段A-从灌注梭状芽胞杆菌的启动子的启动子的启动子的上游区域中存在五个新型弯曲蛋白基因，是一种新型的弯曲DNA，具有强烈的弯曲角度为110°。据表明，三个上游A诱饵和两个下游A诱饵的协同作用激活了铁氧还蛋白的启动子。将此特殊的排气启动子克隆到PPSV，ppsv，pperthtle载体和渗透杆菌/大肠杆菌的启动子选择载体，以构建高表达载体PFF。为了研究灌注梭状芽胞杆菌/PFF系统的效用，构建了灌注链球念珠菌的75 kDa sialidase（Nani）的结构基因和PFF，并构建了PFF。作为对照，构建了载体PPSVN，并纳入了NANI基因的整个区域。此外，将NANI克隆到PUC19中，以比较其在大肠杆菌BL21（DE3）Codonplus-ril中生产NANI的能力，该核糖层被开发为富裕基因的高度表达系统。 C.刺激/PFFN显示出灌注梭菌/PPSVN的60倍，大约是大肠杆菌产量的15倍。使用两步纯化方法从100 mL培养溶液中纯化了大约3毫克的高纯度NANI。从上述情况下，已经揭示了五角梭化/PFF系统可用于高表达唾液酸酶。类似地检查了120 kDa胶原酶基因的PFF的有用性，尽管表达水平得到改善，但也观察到降解产物，就像培养C.灌注细菌时一样。据透露，为了产生胶原酶，有必要考虑未来蛋白酶缺陷的突变体和培养条件。