ウェルシュ菌産生壊死毒素(NetB)の鶏壊死性腸炎発症に関与する宿主側因子の特定

产气荚膜梭菌产生的坏死毒素（NetB）引起鸡坏死性肠炎的宿主因素的鉴定

• 批准号: 22K06007
• 负责人: 向本 雅郁
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osaka Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06007/
• 关键词: NetB; 受容体; ウェルシュ菌; 小腸上皮細胞; ニワトリ; siRNA; ウエルシュ菌; 鶏; 壊死性腸炎

これまでの研究で作製したLMH細胞の細胞膜に対するモノクローナル抗体の中からNetBのLMH細胞への結合を阻害する抗体を選別した。LC-MS/MSにより、この抗体が認識する分子をNetB受容体候補分子とし、受容体の特定を行った。LC-MS/MSの結果からニワトリデータベースを用いて解析し、哺乳類との相同性が低い分子を検索した。その結果、同定確率が100％で哺乳類との相同性が低かったミクロソームトリグリセリド輸送蛋白（MTTP）とトランスフェリン受容体蛋白（TFRC）を受容体の第1候補として、これらのsiRNAを用いて蛋白発現を抑制されたLMH細胞におけるNetB感受性を評価した。MTTPおよびTFRCのｍRNAを標的とするsiRNAを各5種類合成し、RT-qPCRによりｍRNA発現量を比較することで使用するsiRNAを決定した。5nMのMTTP siRNAではsiMTTP-3は33％、siMTTP-4は37％のｍRNA発現量を抑制した、TFRC-1および-2ではいずれも55％の抑制を示した。siRNA量を50nMに増量したとき、これらのsiRNAはいずれもｍRNA発現量がさらに低下したため、siRNAは50nMで以降の実験に使用した。なお、LMH細胞にこれらのsiRNAを導入したとき、細胞生存率の減少がみられなかったことから、いずれのsiRNAも細胞の生存・増殖に影響しないことが明らかとなった。それぞれのsiRNAをLMH細胞に導入し48時間後に5EC50/mlのNetBを加え、24時間反応後、MTT法により細胞の生存率を測定した。その結果、無関係のsiRNAを導入したネガティブコントロール群と比較して、いずれのsiRNA導入群で生存率に有意な違いは見られなかった。以上の結果より、今回選定したMTTPおよびTFRCはNetBの受容体でないことが明らかとなった。

我们从之前研究中制备的针对LMH细胞膜的单克隆抗体中选择了抑制NetB与LMH细胞结合的抗体。通过LC-MS/MS将该抗体识别的分子鉴定为NetB受体候选分子，并鉴定了受体。使用鸡数据库分析 LC-MS/MS 结果，以搜索与哺乳动物具有低同源性的分子。结果，鉴定概率为100%且与哺乳动物同源性较低的微粒体甘油三酯转运蛋白（MTTP）和转铁蛋白受体蛋白（TFRC）被选为第一批候选受体，并利用这些siRNA来表达蛋白表达评估了受抑制的 LMH 细胞的 NetB 敏感性。合成了分别针对MTTP和TFRC mRNA的五种siRNA，并通过RT-qPCR比较mRNA表达水平来确定要使用的siRNA。使用5 nM MTTP siRNA，siMTTP-3将mRNA表达水平抑制33%，siMTTP-4将mRNA表达水平抑制37%，TFRC-1和-2均显示55%抑制。当siRNA的量增加到50nM时，所有这些siRNA的mRNA表达水平进一步下降，因此在后续实验中使用50nM的siRNA。此外，当这些 siRNA 被引入 LMH 细胞时，没有观察到细胞存活率下降，这表明没有任何 siRNA 影响细胞存活或增殖。将各siRNA导入LMH细胞，48小时后添加5EC50/ml的NetB，反应24小时后，通过MTT法测定细胞活力。结果，与引入不相关siRNA的阴性对照组相比，在任何引入siRNA的组中都没有观察到存活率的显着差异。从以上结果可以看出，本次选择的MTTP和TFRC不是NetB的受体。