内分泌かく乱物質による晩発障害発生の分子メカニズムの解析

内分泌干扰物引起迟发性疾病的分子机制分析

基本信息

批准号：
12836002
负责人：
赤坂武
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12836002/
关键词：
ポリコーム群クロマチンスプライセオソーム Hox Mel18 Bmi1 DES

项目摘要

ショウジョウバエ・ポリコーム遺伝子群であるMel-18とBmi-1遺伝子産物の機能を分子レベルで明確にしていくことが,本研究の目的であり、それらの作用機序について以下のように解析を行った。(1)HoxクラスターにおけるMel-18結合領域同定の試み。染色体上のMel-18結合領域を明らかにするために、クロマチンDNAとMel-18の複合体の免疫共沈を試みた。パラフォルムアルデヒドを用いて、マウス11.5日胚を固定し、超音波処理によりクロマチンDNA/Mel-18複合体を可溶化した。約1kBの断片として可溶化する条件を明らかにした。セシウム濃度勾配を用いて、フリーのタンパク、クロマチンDNA/タンパク複合体、フリーのクロマチンDNAを分画したところ、Mel-18とBmi-1とBmi-1遺伝子産物は、クロマチンDNA/タンパク複合体の分画にのみ存在することが明らかになった。これとは対照的に、Mel-18とBmi-1のインターラクターであるRing1Bは、クロマチンに結合している分画だけではなく、結合していない分画にも含まれることが明らかになった。Ring1Bも、Hoxクラスターの転写制御に寄与することを明らかにしているので、クロマチン結合型のRing1Bが、Mel-18とBmi-1と複合体を構成してポリコーム複合体として機能することが示唆された。Mel-18と免疫共沈されてくるクロマチンDNAに含まれるHoxクラスターの頻度をHoxb7/b8/b9に焦点を絞って系統的に検索している。(2)155kDaスプライセオソーム結合タンパク(SAP155)によるポリコーム複合体機能の調節Mel-18とRing1Bのインターラクターとして同定したSAP155は、マウス胚においても構成的にMel-18とRing1Bに結合していることが明らかになった。SAP155を欠損したマウスは、8細胞期におこるコンパクションを維持できず、それ以上に発生は進まない。SAP155とMel-18やMph1二重へテロ接合体では、それぞれのへテロ接合体では観察されないホメオチック変異が中軸骨格系で観察された。また、クロマチン結合分画にもSAP155が見られたことから、一部のSAP155はポリコーム複合体のコンポーネントとしても作用する可能性が示された。(3)DESによるHox発現の変化の検索胎児期にDESを連続投与することにより、子宮においてHox遺伝子発現が誘導されることを明らかにした。

本研究的目的是在分子水平上阐明果蝇polycomb基因产物Mel-18和Bmi-1的功能，并分析其作用机制如下。 (1)尝试识别Hox簇中的Mel-18结合区域。为了澄清染色体上的 Mel-18 结合区域，我们尝试对染色质 DNA 和 Mel-18 复合物进行免疫共沉淀。使用多聚甲醛固定 11.5 天的小鼠胚胎，并通过超声处理溶解染色质 DNA/Mel-18 复合物。澄清了约1kB片段的溶解条件。使用铯浓度梯度分离游离蛋白质、染色质DNA/蛋白质复合物和游离染色质DNA，我们发现在染色质DNA/蛋白质复合物中发现了Mel-18、Bmi-1和Bmi-1基因产物。它仅以分数形式存在。相比之下，Ring1B（Mel-18 和 Bmi-1 的相互作用因子）不仅存在于染色质结合部分中，而且还存在于未结合部分中。 Ring1B 也被证明有助于 Hox 簇的转录调节，这表明染色质结合的 Ring1B 通过与 Mel-18 和 Bmi-1 形成复合物而发挥多梳复合物的作用。我们正在系统地搜索与 Mel-18 免疫共沉淀的染色质 DNA 中包含的 Hox 簇的频率，重点关注 Hoxb7/b8/b9。 (2)155kDa剪接体结合蛋白(SAP155)对Polycomb复合体功能的调节已明确，SAP155被鉴定为Mel-18和Ring1B的相互作用蛋白，甚至在小鼠胚胎中也与Mel-18和Ring1B组成型结合。缺乏 SAP155 的小鼠无法维持 8 细胞阶段发生的压缩，并且发育不会在该阶段之后继续进行。在 SAP155、Mel-18 和 Mph1 双杂合子中，在中枢骨骼系统中观察到在各自杂合子中未观察到的同源突变。此外，在染色质结合部分中也观察到 SAP155，表明某些 SAP155 也可能充当多梳复合物的组成部分。 (3)寻找DES引起的Hox表达变化我们发现，通过在胎儿期持续施用DES，在子宫中诱导Hox基因表达。