放線菌ストレプトミセス・グリセウスのゲノム解析のための基盤整備

放线菌灰色链霉菌基因组分析的基础设施开发

基本信息

批准号：
12206022
负责人：
堀之内末治
金额：
--
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206022/
关键词：
ゲノムライブラリー放線菌 Streptomyces griseus 形態形成抗生物質生産

项目摘要

放線菌は多種多様な生理活性物質の生産菌として重要な工業微生物であるとともに、細胞の形態分化のモデル生物として基礎生物学の格好の材料である。我々の大きな目標は、ストレプトマイシン生産菌であるS.griseus IFO 13350株の全ゲノム配列(8Mb)を決定することであるが、その前段階としてS.griseusゲノムの整列化BACライブラリーを作製した。S.griseus染色体DNAをBamHIで部分分解後パルスフィードル電気泳動により分画し、約100kb以上のDNA断片をBACベクター(pBeloBAC11)にクローニングし、1440クローンからなるBACライブラリー(平均インサーション約80kb)を構築した。T7およびSP6RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写により、任意のクローンの挿入DNA両末端に対するdigoxigeninラベルRNAプローブを作製し、BAC DNAを固定したナイロンメンブレンを用いたハイブリダイゼーションにより、そのクローンとオーバーラップするDNAを持つクローンを選択した。総計624クローンを用いてこの操作を繰り返すことによって、174クローンからなる整列化BACライブラリーが構築できた。本整列化BACライブラリーは4つのギャップ領域が存在するものの、ゲノムのほぼ全長をカバーしていると考えられる。現在、染色体DNAのDraI,AseI断片をラベルし、整列化BACクローン群とハイブリダイゼーションを行なうことによって、DraI、AseIによるゲノムの制限酵素地図を作製するとともに、整列化BACクローン群の染色体上での位置の特定を進めている。一方、A-ファクター制御カスケード内の役者を同定するために、カスケード内の転写因子AdpAが結合するDNA断片をゲルシフト-PCR法にて20種以上取得した。取得したDNA断片を含む大きなDNA断片をクローニング、塩基配列決定による遺伝子の同定、A-ファクター依存性の転写の有無を確認した。その中の1つは、外界の環境変化に応答して転写を起こすシグマ因子をコードしていた。このシグマは、二次代謝には関係せず、形態分化にのみ関係していた。

放线菌是重要的工业微生物作为细菌，可产生多种生理活性物质，也是基本生物学作为模型生物学的理想材料，作为细胞形态学分化的模型生物。我们的主要目标是确定产生链霉素的细菌的整个基因组序列（8 Mb），S。griseusifo 13350，一种阶段的阶段前，对齐的Griseus S. griseus基因组的BAC文库。将S. griseus染色体DNA部分分解为BAMHI并用脉搏馈线电泳分离，将约100 kb或更多的DNA片段克隆到BAC载体（Pbelobac11）中，以构建一个由1440个克隆组成的BAC（平均插入量约为80 kb）。使用T7和SP6 RNA聚合酶在体外转录中为任何克隆的插入的DNA的两端制备了二氧基素标记的RNA探针，并使用尼龙膜与固定化的BAC DNA选择了与克隆重叠的克隆。通过使用总共624个克隆重复此过程，可以构建一个174个克隆。尽管该对齐的BAC库有四个间隙区域，但据信它几乎涵盖了基因组的整个长度。目前，通过将染色体DNA的Drai和ASEI片段标记并与对齐的BAC克隆组杂交，我们正在使用DRAI和ASEI创建限制基因组的限制酶图，我们还在努力识别染色体上对齐BAC克隆的位置。另一方面，为了识别A因子控制的级联反应中的参与者，通过Gel Shift-PCR获得了20多种由转录因子ADPA结合的20多种DNA片段。克隆包含包含所获得的DNA片段的大型DNA片段，并通过碱基测序确认基因鉴定，以及是否存在A因子依赖性转录。其中一个编码了一个Sigma因子，该因子会导致转录，以应对外部环境的变化。该西格玛与继发代谢无关，而仅与形态学分化有关。