免疫グロブリンクラススイッチ誘導シグナル伝達系におけるKuの役割に関する研究

Ku在免疫球蛋白类开关诱导信号转导系统中的作用研究

基本信息

批准号：
12051215
负责人：
森尾友宏
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12051215/
关键词：
Ku70 80 DNA-PK IL-4 CD40 CD23 translocation

项目摘要

#1 IL-4/CD40刺激後にKuが核内に移行する機構の解析今回の検討からKu70/80のチロシン残基がリン酸化されることが判明した。細胞質と核で比較すると、Kuのチロシンリン酸化の程度は細胞質内の方がより強いらしい。チロシンリン酸化が核内移行に関係しているかを検討するため、まずチロシンリン酸化部位の同定を試みている。Ku70,Ku80をCNBrで切断後、抗リン酸化チロシンブロットを行ったところ、Ku70,Ku80共1フラグメントのみがチロシンリン酸化バンドとして認められている。現在、他の消化酵素を用いTOF-MSにてリン酸化部位を同定中である。#2 KuのCD23遺伝子発現調節機構の解析KuはCD23のエンハンサー領域に結合する。IL-4R/CD40の共刺激によって核内に誘導されたKuによるCD23の発現調節を検討するため、CD23のプロモーター領域とCD23のエンハンサー領域を組み入れたルシフェラーゼベクターをB細胞株に遺伝子導入し、レポーター遺伝子アッセイを行った。細胞株やプロモーターの構成によって、IL-4R/CD40刺激後にエンハンサー活性が増強する場合と減弱する場合がありさらに詳しく解析している。#3 B細胞分化段階におけるKuの局在成熟B細胞ではKuの大半は細胞質内に局在する。ProBII,PreBII,成熟B細胞においてのKuの局在を細胞株を用いて検討したところ、細胞質内Ku/核内Ku発現量比はProB>PreB>matureBの順であった。#4 CD40と会合するKu70/80の部位、Kuと会合する分子の解析Ku70/80のいずれがCD40と会合するのかを明らかにし、結合部位を同定するため、Ku70を7〜8つの部分に分けてGSTとの融合タンパクを作成した。Kuと会合する分子に関しては複数のホモログを用意して、会合に必須のモチーフを検討している。

#1 IL-4/CD40刺激后Ku转入细胞核的机制分析本研究表明Ku70/80的酪氨酸残基被磷酸化。比较细胞质和细胞核，Ku的酪氨酸磷酸化程度似乎在细胞质中更强。为了研究酪氨酸磷酸化是否与核输入有关，我们首先尝试鉴定酪氨酸磷酸化位点。用CNBr切割Ku70和Ku80后，进行抗磷酸酪氨酸印迹，仅Ku70和Ku80的一个片段被识别为酪氨酸磷酸化条带。我们目前正在使用其他消化酶使用 TOF-MS 来识别磷酸化位点。 #2 Ku调控CD23基因表达的机制分析 Ku与CD23的增强子区结合。为了检查通过 IL-4R/CD40 共刺激诱导进入细胞核的 Ku 对 CD23 表达的调节，我们将包含 CD23 启动子区和 CD23 增强子区的荧光素酶载体转染到 B 细胞系中，并使用报告基因。进行了化验。根据细胞系和启动子配置，增强子活性在 IL-4R/CD40 刺激后可能会增强或减弱，目前正在对此进行更详细的分析。 #3 Ku 在 B 细胞分化阶段的定位在成熟 B 细胞中，大部分 Ku 位于细胞质内。当使用细胞系研究Ku在ProBII、PreBII和成熟B细胞中的定位时，细胞质Ku/核Ku的表达比的顺序为ProB>PreB>matureB。 #4 Ku70/80 与 CD40 结合的部分以及与 Ku 结合的分子的分析为了明确 Ku70/80 的哪一部分与 CD40 结合并识别结合位点，我们将 Ku70 分为 7 至 8 个融合体。含有 GST 的蛋白质被创建。对于与 Ku 相关的分子，我们已经制备了多种同源物，并正在研究关联所必需的基序。