インビトロ選択法とコンビケム法による超分子認識素子の開発

利用体外选择法和combichem法开发超分子识别装置

基本信息

批准号：
12019269
负责人：
杉本直己
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Konan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、遺伝子の機能を迅速かつ簡便に解明する手法である、DNAチップ法が注目を集めている。これは、相補的な核酸同士が互いに"認識"することを利用した技術である。しかしながら、"機能"を有するDNAチップの開発は未だなされていない。一方、核酸の未知の機能が次々と発見され、生体系の共有結合の切断に対して触媒機能を有するデオキシリボサイムが注目されている。このデオキシリボサイムは、金属イオンの助けを借りながら遺伝子を"認識"し、さらに切断するという"機能"を有する分子である。このような機能性分子をチップ上に固定化できれば、相補鎖認識だけでなく機能も併せ持つ機能性DNAチップとして活用できるという期待が高まっている。本研究では、短鎖デオキシリボサイムを機能性分子として捉え、核酸の"認識"と切断の"機能"を併せ持つ超分子認識素子(デオキシリボサイム素子)の開発について検討した。インビトロ選択法により見いだされたオリジナル・デオキシリボザイムの活性部位のダウンサイジングを行い、ループ内の塩基配列及び金属イオンの種類の両方により、RNA切断反応性を制御できるCa2+依存型短鎖デオキシリボサイムを開発した。この短鎖デオキシリボサイムを利用した超分子認識素子を創製するために、短鎖デオキシリボザイムの5'末端をアビジン-ビオチン相互作用を利用してAvidin Gelに固定化した。このデオキシリボザイム素子を用いてCa2+存在下でRNA(rGAAGACA_UGCCAGCG;_はRNA切断部位を示す)切断反応を行った結果、RNA切断部位はrAU間の1ヶ所を特異的に切断することがわかった。

近年来，DNA芯片方法是一种快速，易于阐明基因函数的方法，引起了人们的注意。这是一种利用互补核酸的“识别”的技术。但是，尚未开发“功能性” DNA芯片。同时，已经发现了核酸的未知功能，并且对脱氧核糖素的关注也引起了人们的注意，这些脱氧核糖是在生物系统中具有共价键的催化功能。该脱氧核糖体是一种具有“识别”基因并在金属离子的帮助下裂解的分子。如果将这种功能分子固定在芯片上，则越来越希望它们可以用作功能性DNA芯片，不仅可以识别互补的链，而且具有功能。在这项研究中，我们讨论了一种超分子识别装置（脱氧核糖素设备）的开发，该装置将短链脱氧核糖素视为功能分子，并具有“识别”和核酸裂解的功能。我们已经缩小了原始脱氧核酶的活性位点，它是通过体外选择发现的，并开发了一种依赖于Ca2+的短链脱氧核糖素，该短链脱氧核糖核物可以控制RNA裂解反应性，这取决于环中的基本序列和金属离子的类型。为了创建使用此短链脱氧蛋白质子的超分子识别装置，使用Avidin-Biotin相互作用将短链脱氧核酶的5'末端固定在Avidin凝胶中。使用该脱氧核酶设备，在Ca2+存在下进行了RNA（RGAAGACA_UGCCAGCG; _表示RNA裂解位点），结果发现RNA裂解位点特异性地裂解了Rau之间的一个位置。