一酸化炭素をエフェクターとする転写調節因子の一酸化炭素応答およびDNA認識機構

以一氧化碳为效应子的转录调节因子的一氧化碳反应和DNA识别机制

• 批准号: 12019222
• 负责人: 青野 重利
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019222/
• 关键词: DNA結合タンパク質; 転写活性化因子; ヘム; キメラタンパク質; 一酸化炭素センサータンパク; レポーター遺伝子

CooAの機能発現には、CooA分子中に含まれるヘムが重要な役割を果たしている。本研究では、ヘム周辺部に変異を導入した各種変異体を調製し、それらの活性構造相関を明らかにすることにより、CooAの機能発現におけるヘムの役割を解明することを目的とした。野生型、および各種変異型CooAを用い、それらのEXAFS、NMR、EPR、共鳴ラマンスペクトル等の各種分光学的測定、さらにin vivoレポーター系をもちいた活性評価を行ない、CooA中に含まれるヘムによるCOセンシング機構、ヘム配位構造の解明に成功した。また、各種変異型CooAおよび変異型プロモータを組合せ、それらの転写活性化能を比較検討することにより、CooAの標的DNAに対するターゲッティング機能制御機構の解明を行なった。その結果、CooAの標的DNAに対するターゲッティング機能は、CooA分子中に存在するヘリックス・ターン・ヘリックス中の三つのアミノ酸残基(Arg177,Gln178,Ser181)によってコントロールされていることが明かとなった。また、CooAの標的DNAは、TGTCA……CGACAで示される配列を有しており、本配列中の下線で示した部分の塩基が、CooAによる認識塩基であることが分かった。さらに、エフェクターセンシングドメインがCRP、DNA認識ドメインがCooA由来の、新規な機能性キメラタンパクの調製に成功し、本キメラ中で転写活性化能発現に関与しているアミノ酸残基を同定した。これらのアミノ酸残基は、RNAポリメラーゼと直接相互作用していると考えられる。

CooA分子中含有的血红素在CooA的功能表达中发挥着重要作用。在本研究中，我们旨在通过制备在血红素外围区域引入突变的各种突变体并阐明它们的活性-结构关系，来阐明血红素在CooA功能表达中的作用。使用野生型和各种突变体 CooA，我们进行了各种光谱测量，例如 EXAFS、NMR、EPR 和共振拉曼光谱，并使用体内报告系统评估了其活性，我们成功地阐明了 CO 传感机制和血红素配位结构。 。此外，通过组合各种突变CooA和突变启动子并比较它们的转录激活能力，我们阐明了控制CooA对靶DNA的靶向功能的机制。结果表明，CooA对靶DNA的靶向功能是由CooA分子中存在的螺旋-转角-螺旋中的三个氨基酸残基(Arg177、Gln178和Ser181)控制的。还发现CooA的目标DNA具有如图TGTCA...CGACA所示的序列，该序列中下划线的碱基是CooA识别的碱基。此外，我们成功制备了一种新型功能性嵌合蛋白，其中效应传感结构域源自CRP，DNA识别结构域源自CooA，并鉴定了该嵌合体中参与转录激活能力表达的氨基酸残基。这些氨基酸残基被认为与 RNA 聚合酶直接相互作用。

项目成果

Takeshi Uchida: "Identification of histidine 77 as the axial heme ligand of carbonmonoxy CooA by picosecond time-resolved resonance Raman spectroscopy"Biochemistry. 39(42). 12747-12752 (2000)

Takeshi Uchida：“通过皮秒时间分辨共振拉曼光谱鉴定组氨酸 77 作为碳单氧基 CooA 的轴向血红素配体”生物化学。

Shigetoshi Aono: "CO sensing and regulation of gene expression by the transcriptional activator CooA"J.Inorg.Biochem.. 82. 51-56 (2000)

Shigetoshi Aono：“转录激活剂 CooA 的 CO 传感和基因表达调节”J.Inorg.Biochem.. 82. 51-56 (2000)

Shigeichi Kumazaki: "Dissociation and recombination between ligands and heme in a CO-sensing transcriptional activator CooA"J.Biol.Chem.. 275(49). 38378-38383 (2000)

Shigeichi Kumazaki：“CO 感应转录激活剂 CooA 中配体和血红素之间的解离和重组”J.Biol.Chem.. 275(49)。

Hiroshi Nakajima: "Control of CooA activity by the mutation at the C-terminal end of the heme-binding domain"J.Inorg.Biochem.. 78. 63-68 (2000)

Hiroshi Nakajima：“通过血红素结合结构域 C 末端突变控制 CooA 活性”J.Inorg.Biochem.. 78. 63-68 (2000)