一酸化炭素をエフェクターとする転写調節因子の一酸化炭素応答およびDNA認識機構

以一氧化碳为效应子的转录调节因子的一氧化碳反应和DNA识别机制

• 批准号: 11132219
• 负责人: 青野 重利
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11132219/
• 关键词: DNA結合蛋白質; 一酸化炭素; COセンサー; ヘム

CooAによる標的DNAの特異的認識、および結合機構を明らかにするため、CooA中に存在するDNA結合モチーフである、ヘリックス・ターン・ヘリックスの認識ヘリックス上のアミノ酸残基に変異を導入した変異型CooA、およびCooAの標的DNA中の塩基に変異を導入した変異型レポーター系を調製し、それらの活性を評価した。CooAにおいて、ヘリックス・ターン・ヘリックス構造中の認識ヘリックスを構成していると考えられる、177残基目から183残基目までのアミノ酸に、それぞれ変異を導入し、それらのin vivoにおける活性を測定した。その結果、Arg177、Gln178、Ser181を、それぞれVal、Glu、Glyに置換した変異型CooAは、エフェクターであるCOの有無によらず、転写活性化因子として不活性であった。一方、Ala183をThrあるいはIleに置換したものは、COの有無によらず、常に活性を示した。上記の位置以外に変異を導入した場合は、野生型CooAの場合と同様、CO存在下でのみ活性を示した。今回使用したin vivoレポーター系では、CooA結合配列として、TGTCA・・・・・・CGACA(・はCooAの結合には関与しないと考えられる塩基を示す)という配列を有している。この配列中の2番目のGをAに、15番目のCをTに置換した場合(G2A/C15Tと記す)、およびA5C/C12Gの変異を導入した場合は、野生型の場合と同様な活性を示した。T3G/A14C、C4A/G13Tの変異を導入した場合には、活性が消失した。これらのことから、変異導入により活性が消失する位置のアミノ酸残基、および塩基が、CooAとDNAとの特異的結合に関与しているものと考えられる。

为了阐明CooA对靶DNA的特异性识别和结合机制，我们设计了一种突变体CooA，其中螺旋-转角-螺旋识别螺旋上的氨基酸残基被引入，这是CooA中存在的DNA结合基序。制备了突变报告系统，其中将突变引入到 CooA 和 CooA 的靶 DNA 碱基中，并评估了它们的活性。在CooA中，将突变引入到被认为构成螺旋-转角-螺旋结构中的识别螺旋的残基177至183的氨基酸中，并测量了它们的体内活性。结果，Arg177、Gln178和Ser181分别被Val、Glu和Gly取代的突变体CooA无论是否存在效应子CO，都作为转录激活剂失活。另一方面，无论CO存在与否，Ala183被Thr或Ile取代的那些总是表现出活性。当在上述位置以外的位置引入突变时，只有在CO存在的情况下才表现出活性，如野生型CooA的情况。这次使用的体内报告系统具有序列TGTCA...CGACA（*表示不被认为参与CooA结合的碱基）作为CooA结合序列。当该序列中的第2个G被A替换并且第15个C被T替换（表示为G2A/C15T），并且当引入A5C/C12G突变时，所表现出的活性与野生型相似。当引入 T3G/A14C 和 C4A/G13T 突变时，活性消失。这些结果表明，突变后失去活性的位置处的氨基酸残基和碱基参与了CooA和DNA之间的特异性结合。

项目成果

H. Nakajima: "Control of CooA activity by the mutation at the C-terminal end of the heme-binding domain"J. Inorg. Biochem.. 78(1). 63-68 (2000)

H. Nakajima：“通过血红素结合域 C 末端的突变控制 CooA 活性”J.

S. Aono: "Structure and function of CooA, a novel transcriptional regulator containing a b-type heme as CO sensor"Coord. Chem. Rev.. 190-192. 267-282 (1999)

S. Aono：“CooA 的结构和功能，一种含有 b 型血红素作为 CO 传感器的新型转录调节因子”Coord。

H. Nakajima: "Electrochemical evidence of the redox-controlled ligand exchange of the heme in the CO-sensing transcriptional activator CooA"Chem. Lett.. 11. 1233-1234 (1999)

H. Nakajima：“CO 感应转录激活剂 CooA 中血红素氧化还原控制的配体交换的电化学证据”Chem。

S. Aono: "Recognition of target DNA and transcription activation by the CO-sensing transcriptional activator CooA"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 261(2). 270-275 (1999)

S. Aono：“CO 感应转录激活剂 CooA 识别靶标 DNA 和转录激活”Biochem。