Campylobacter rectusの熱ショックタンパク質の遺伝子解析

直肠弯曲杆菌热休克蛋白的遗传分析

基本信息

批准号：
11877363
负责人：
中村亮
金额：
--
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

歯周病原性細菌の1つであるCampylobacter rectus菌体より熱ショックタンパク質に属するGroEL様タンパク質を抽出し、この分子の構造解析を試みた。ATP-agaroseカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーとSDS-PAGEを応用した電気溶出により得られた64kDaタンパク質のN末端アミノ酸配列はAKEIFFSDEARNRLYEGVRKLNDAVKVTMGPRGRNであり、SwissProt data bankを利用した相同性の探索によりHelicobacter pylori GroELと83%(29残基/35残基)と特に高い相同性を示すことが明らかとなった。そこで、このデータを利用したセンスプライマー及びH.pylori含め他の細菌由来GroELにおいても相同性の高いC末端側配列(-GGMGGMM)を利用してアンチセンスプライマーを設計し、C.rectus由来genomic DNAをテンプレートとしたPCRを行った。PCR産物はアガロース電気泳動にて純度を確認後、digoxigenin標識してプローブとした。C.rectus genomic DNAを制限酵素で切断後、サンプルを電気泳動、膜転写して前述のプローブによるサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Hind IIIは1450と948bp、Pst Iは2950bp、Bam HIは6400bpの部位で反応バンドが認められた。今後、Pst I処理サンプルの反応バンド付近のDNA断片を抽出し、ベクターに組み込んだ後、大腸菌へ形質転換させて、C.rectus GroEL様タンパク質の遺伝子解析を進めていく予定である。

我们从牙周病原菌直肠弯曲杆菌中提取了一种属于热休克蛋白的GroEL样蛋白，并尝试分析该分子的结构。通过ATP-琼脂糖柱亲和层析和SDS-PAGE电洗脱得到的64kDa蛋白的N端氨基酸序列为AKEIFFSDEARNRLYEGVRKLNDAVKVTMGPRGRN，使用SwissProt数据库同源性检索显示幽门螺杆菌与GroEL的同源性特别高，为83％(29个残基/35个残基)。因此，我们使用该数据设计了正义引物，并使用与其他细菌（包括幽门螺杆菌）的 GroEL 高度同源的 C 端序列 (-GGMGGMM) 设计了反义引物，并设计了直肠杆菌 PCR 的基因组 DNA。是使用它作为模板来执行的。通过琼脂糖电泳确认PCR产物的纯度后，用地高辛标记并用作探针。用限制酶切割C.直肌基因组DNA后，将样品电泳，转移到膜上，并使用前述探针进行Southern杂交，Hind III为1450和948bp，Pst I为2950bp，Bam HI为2950bp。在该位点观察到一条反应带。未来，我们计划提取Pst I处理样品反应带附近的DNA片段，将其整合到载体中，将其转化到大肠杆菌中，并对直肠直肌GroEL样蛋白进行遗传分析。