両指向性HIVを支持する新規HIVコレセプターの単離とその解析

支持双向性 HIV 的新型 HIV 辅助受体的分离和分析

基本信息

批准号：
11161222
负责人：
前田洋助
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Mip-1α抵抗性R5 HIVの樹立HIVの感染にはその標的細胞上のCD4分子及びケモカイン受容体であるCXCR4ないしCCR5分子がその侵入に必須であり、CXCR4がT細胞株HIV(X4 HIV)、CCR5がマクロファージ指向性HIV(R5)の感染を支持することが明かとなっている。また、HIV感染の病態進行にしたがい、ウイルスはR5からX4へと進化していくと考えられているが、そのメカニズムについては未だ明らかではない。一般にマクロファージ指向性HIV感染はCCR5の正常リガンドであるC-Cケモカイン類、MIP-1α,MIP-1β,RANTESにより阻害され、CXCR4のリガンドであるSDF-1には抵抗性である。そこで、このようなC-Cケモカインの存在がR5からX4への進化と関連しているのではないかと考え、in vitroにおいてR5 HIV感受性T細胞株であるCCR5発現MOLT-4#8(MOLT-4#8/CCR5)を標的細胞として、MIP-1α存在下でR5 HIVからMIP-1α抵抗性ウイルスを樹立し、このような抵抗性の獲得がHIVのR5からX4へのシフトに関与しているかどうか検討した。得られたMIP-1α抵抗性ウイルスは、CD4及びCCR5発現HeLa細胞であるMAGI/CCR5を使用したアッセイ系で、親株のJR-FLと比較して、約4-5倍の耐性を示していた。またウイルスエンベロープのアミノ酸配列上、親株と比較しV2とV3と呼ばれる変異に富んだ領域にそれぞれ単一アミノ酸変異が認められた。すなわち抵抗性HIVのV2領域においてはバリンからメチオニン(V166M)への、V3領域においてはセリンからグリシン(S303G)への変異が生じていた。これらの変異の中で、いずれのアミノ酸変異がその抵抗性付与に関連しているかを検討するために、V2,V3領域単独変異及び両者の変異をもつHIVエンベローブ発現ベクターと、ルシフェラーゼをリポーター遺伝子としてもつHIVとのシュードタイプHIVを作製し、MAGI/CCR5を標的細胞としてMIP-1α抵抗性について検討した。その結果V2及びV3領域の両者の変異がMIP-1α抵抗性に必要であることが判明した。しかしながら、このウイルスのケモカイン受容体利用性は親株と同様にCCR5だけであり、CXCR4へとは変化していなかった。これらの所見より、このようなC-Cケモカインの存在はR5からX4へ進化のプレッシャーとしては機能していないと考えられたが、CCR5を利用しながらC-Cケモカイン抵抗性を獲得するウイルスがin vitroで存在できうることから、HIVのエンベロープの侵入に際してのCCR5認識と、正常リガンドであるMIP-1αのCCR5の認識は、まったく同一ではなく分子学的に差違があることが明かとなった。さらにはエンベロープのCCR5認識にはV3領域が主要な働きをしていることが以前より報告されていたが、今回の所見からV2領域もその認識に関連していることが明かとなった。

在其靶细胞上建立CD4分子和趋化因子受体CXCR4或CCR5分子的抗MIP-1α耐药物对于其侵入至关重要，并且已经发现CXCR4支持感染T细胞系HIV HIV HIV（X4 HIV）（X4 HIV）和CCR5支持感染，并伴有CCR5支持感染了型HIV（R5）。此外，人们认为该病毒会根据HIV感染的进展从R5演变为X4，但该机制的机制仍然不清楚。巨噬细胞指导的HIV感染通常受到C-C趋化因子，MIP-1α，MIP-1β和RANTES的抑制作用，后者是CCR5的正常配体，并且对CXCR4的配体具有抗性SDF-1。 Therefore, we thought that the presence of such C-C chemokines may be related to the evolution of R5 to X4, and established a MIP-1α-resistant virus from R5 HIV in the presence of MIP-1α in vitro using CCR5-expressing MOLT-4#8 (MOLT-4#8/CCR5), an R5 HIV-sensitive T cell line, as a target cell, and examined whether this acquisition of resistance is involved in the shift从R5到X4的艾滋病毒。使用MAGI/CCR5，CD4-和表达CCR5的HELA细胞，在测定系统中，在测定系统中，最终的MIP-1α耐药性病毒对父母菌株JR-FL的抗性约4-5倍。此外，与母体菌株相比，在富含称为V2和V3的突变的区域的病毒包膜的氨基酸序列中观察到单氨基酸突变。也就是说，突变发生在抗性HIV的V2区域中的Valine到蛋氨酸（V166M），以及V3区域的丝氨酸到甘氨酸（S303G）的突变。为了研究这些突变中的哪一个与赋予电阻有关，我们创建了单独携带V2和V3区域的HIV包膜表达载体的伪型HIV，并在两者中携带V2和V3区域的突变，并以Luciferase作为报告基因，并使用MAGI/CCR5作为目标细胞检查了MIP-1α耐药性。结果表明，MIP-1α电阻需要V2和V3区域中的突变。然而，该病毒的趋化因子受体的可用性是CCR5，就像母菌株一样，并未改变为CXCR4。这些发现表明，这种C-C趋化因子的存在并不是从R5到X4进化的压力，但是由于使用CCR5同时获得C-C趋化因子耐药性的病毒可以在体外存在，因此很明显，CCR5在进入HIV封装和CCR5识别MIP-1α时的CCR5识别，而MIP-1α的识别，而不是正常的ligandical，而不是识别的，而是分子的。此外，以前有报道称，V3区域在识别CCR5中起着主要作用，但这发现表明V2区域也与该识别有关。