制癌の標的分子としての糖脂質糖鎖遺伝子(ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子)

糖脂糖链基因（神经节苷脂GM3合酶基因）作为癌症预防的靶分子

基本信息

批准号：
11140282
负责人：
齋藤政樹
金额：
$ 4.8万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

当該研究期間内に、以下の諸点を明らかにした:(1)酸性糖脂質ガングリオシド合成系のキーエンザイムであるヒトGM3合成シアル酸転移酵素の遺伝子のゲノム構造解析を行った。ヒト染色体DNAのBACライブラリーをスクリーニングすることによって、ゲノム全長を含むゲノミックローンを単離し、さらにエクソン・イントロン構造の解明と転写開始点の決定を行い、FISH法により当該遺伝子の染色体上の位置(2p11.1)を確認した。マウスの当該遺伝子の染色体上の位置は6Cであった。(2)マウスでは5'-RACE法で最上流エクソンのみが異なる3種類の転写物(L型、B1型、B2型)が明らかになった。ノーザンブロット解析で組織及び種特異性が明らかになった。ラット及びサルGM3合成酵素cDNAをクローニングしヒト及びマウス遺伝子と比較検討した。これらの単離ホモローグにもヒト及びマウスで見られたアミノ酸置換(アスパラギン酸がヒスチジンに置換)が確認され、哺乳類でこのアミノ酸置換の重要な意味が内包されていることが示唆された。(3)本酵素はペプチド部が41.2-41.7kDaの糖蛋白質であると推定され、C末端をMyc-tag標識したConstructでWestern blot解析した。N結合型糖鎖結合可能部位に突然変異を入れ、野生型と糖鎖欠損型酵素の酵素活性・動態を比較し、シアリルモチーフL中の特異的なHis177残基の変異体を作製し、酵素活性・動態を比較したが、明確な結論には至っていない。ガングリオシドの包括的生物機能解析のためGM3合成酵素欠損マウス作出のためのターゲッチングベクターの構築を行い、ES細胞への導入を開始した。(4)ヒト遺伝子ノックアウト細胞作成のため、GM3合成酵素ゲノムDNAからpositive and negative selection vector及びpromoter less vectorを作成、数種類の付着性及び浮遊性がん細胞株に導入しホモ相同組み換えを起こした細胞のクローニングを開始した。(5)またメラノーマ12日本人症例から4症例の細胞株化に成功した。コーカシアン系のメラノーマ細胞株を含め5株の培養細胞に、GD3合成酵素cDNAを組み込んだsense及びantisense vectorを導入し、変異株を複数分離した。antisense vector導入株の一部に、GD3産生能低下と増殖能低下を認めた。

在研究期间，阐明了以下几点：（1）对人GM3合成唾液酸迁移酶进行基因组结构分析，该酶是酸性糖脂质神经节合成的关键 - 酶。通过筛选人类染色体DNA的BAC文库，分离了包括基因组长度的基因组贷款，并确定了Exonson -Intron结构，并确定了转录起始点，并且FISH方法具有基因染色体的位置（） 2p11.1）。小鼠的染色体位置为6c。（2）在鼠标中，已经揭示了三种类型的转录（L型，B1型，B2类型），仅在5'-Race方法中具有顶部流exonson。北印迹分析揭示了组织和物种特异性。大鼠和猴子GM3合成酶克隆并与人和小鼠基因进行比较。这些Isologoggos还被证实在人类和小鼠中发现了氨基酸取代（用组氨酸替代了天帕酸），这表明哺乳动物含有这种氨基酸替代的重要含义。（3）假定该酶是41.2-41.7KDA糖蛋白，并且是对Western blot的分析，其中具有MYC-TAG的构建体为C端签名。将N结合型糖链组合与野生型的酶活性和动力学进行了比较，并产生了CIALIC基序中的特定HIS177残留物，并产生酶比较活动和动力学，但尚未得出明确的结论。对于神经节的综合生物学功能分析，建立了靶向载体，以创建GM3合成酶缺乏小鼠，并开始引入ES细胞。（4）为了创建人类基因敲除，创建一个正面和负的选择载体和启动子，并引入了我开始克隆的细胞。（5）媒介瘤也成功地从人体病例到4例。将感觉和反义载体掺入GD3合成酶cDNA被引入五个培养细胞中，包括基于高加索的黑色素切开术细胞库存，并分离多个突变股。一些反义载体引入的股份表明，GD3的生产力和增殖有所下降。