造血幹細胞の増殖・分化能を維持する骨髄間質細胞由来の膜蛋白分子の分離・同定と応用

维持造血干细胞增殖和分化能力的骨髓基质细胞膜蛋白分子的分离、鉴定及应用

• 批准号: 16659259
• 负责人: 齋藤 政樹
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Meiji Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659259/
• 关键词: 骨髄長期培養法LT-BMC; 告血幹細胞KSL細胞; 膜タンパク分子Thsd1; Tmtsp; 告血幹細胞増幅維持因子; 間質細胞; 間葉系細胞; 膜タンパク分子mKirre; NEPH2; 浩血支持能; LTC-IC法(Long-term culture initiating cell assay); 造血幹細胞KSL細胞; 造血幹細胞増幅維持因子; ガングリオシド分子種; ボツリヌス毒素C型; D型受容体; 造血幹細胞・前駆細胞; 膜型糖蛋白分子mKirre; Wn

平成18年度は以下の実験結果を得た:我々を含めた幾つかの研究グループにより発見された2種の膜(糖)蛋白に着目し、造血幹細胞/前駆細胞に対する支持能力、増幅能力に関する生物機能を解析した。一つは上野・齋藤らがストローマ細胞株OP9細胞からシグナル配列単離法で単離に成功した膜糖蛋白mKirre/NEPH2であり、もう一つは最近、高柳・中内らにより単離・同定され、未熟な造血幹細胞の膜上に発現していることが判明した膜蛋白Tmtsp/Thsd1である。マウスC57BL/6の骨髄とOP9細胞から抽出したRNAを用いてRT-PCRを行い、マウス骨髄とOP9細胞に膜蛋白質遺伝子mKirreとTmtspが発現していることを確認した。また、骨髄内においては間葉系細胞に限局したmKirre蛋自の発現が判明した。両膜蛋白の機能を解析するため、mKirreについては、マウス骨髄のcDNAライブラリーからスクリーニングしたcDNAとOP9細胞から抽出したRNAにRT-PCRを用いて得たものを発現ベクターにサブクローニングした。Tmtspについては、骨髄から抽出したRNAにRT-PCRを用いて得たcDNAを発現ベクターにサブクローニングした。これらをOP9細胞をはじめとする間葉系細胞(株)、及びCOS7やCHO-k1などの非間葉系細胞(株)に、それぞれトランスフェクションさせ、膜蛋白遺伝子強発現株細胞(mKirre強発現株及びTmtsp強発現株)を樹立し、造血支持能の検索に供した。マウスC57BL/6の骨髄細胞を抗表面抗原抗体カクテルを用いてフローサイトメトリーにて純化した造血幹細胞KSL(CD34^+c-Kit^+Sca-1^+Lin^-)をmKirre強発現細胞と10週間に渡って共培養した。そこから得られた細胞を回収しメチルセルロース半固形培地で12日間培養しコロニーを形成させた。このコロニー数をカウントすることでLTC-IC (Long Term Culture-Initiating Cell)のコロニー形成能を算定し、造血能を測定した。その結果、膜蛋自mKirre強発現間葉系細胞(株)との共培養により得られたコロニー数は対照培養(mock導入間葉系細胞と共培養)より得られたコロニー数に比べ有意に増加した。同様に、KSL細胞をTmtsp/Thsd1強発現間葉系細胞(株)と共培養したところ有意なLTC-ICコロニー数の増加を認めた。すなわち、間葉系細胞に発現する2種の膜(糖)蛋白mKirre及びTmtspは造血に対する支持能を有することが示めされた。一方、遺伝子強発現非間葉系細胞との共培養では造血支持能の増加は認められなかったことから、間葉系に特異的な膜因子が造血能支持に必須なことが示唆された。さらに未熟な、真の造血幹細胞と言われるSP細胞などに対する増幅能の有無を現在検討している。

2006财年，我们获得了以下实验结果：我们针对包括我们在内的多个研究小组发现的两种类型的膜（糖）蛋白，对生物体支持和扩增造血干细胞/祖细胞的功能进行了分析。 。一种是膜糖蛋白mKirre/NEPH2，由Ueno和Saito等人利用信号序列分离方法从基质细胞系OP9细胞中成功分离出来，另一种是最近由Takayanagi和Nakauchi等人分离和鉴定的。发现膜蛋白Tmtsp/Thsd1在未成熟造血干细胞的膜上表达。使用从小鼠C57BL/6骨髓和OP9细胞中提取的RNA进行RT-PCR，证实膜蛋白基因mKirre和Tmtsp在小鼠骨髓和OP9细胞中表达。此外，发现mKirre蛋白的表达仅限于骨髓中的间充质细胞。为了分析这两种膜蛋白的功能，使用从小鼠骨髓 cDNA 文库筛选的 cDNA 和从 RT-PCR 获得的 OP9 细胞中提取的 RNA，将 mKirre 亚克隆到表达载体中。对于Tmtsp，使用RT-PCR对从骨髓提取的RNA获得的cDNA亚克隆到表达载体中。将它们转染至间充质细胞（例如OP9细胞）和非间充质细胞（例如COS7和CHO-k1）中，建立菌株和强表达Tmtsp的菌株，并用于检查支持造血的能力。使用抗表面抗原抗体混合物通过流式细胞术从小鼠 C57BL/6 骨髓细胞中纯化的造血干细胞 KSL (CD34^+c-Kit^+Sca-1^+Lin^-) 用作 mKirre 强表达细胞共培养10周。收集由此获得的细胞并在甲基纤维素半固体培养基中培养12天以形成集落。通过计数集落数，计算LTC-IC(Long Term Culture-Initiating Cell)的集落形成能力，并测定造血能力。结果，通过与强表达膜蛋白mKirre的间充质细胞共培养获得的集落数量显着高于通过对照培养（与模拟引入的间充质细胞共培养）获得的集落数量。同样，当 KSL 细胞与强表达 Tmtsp/Thsd1 的 Mesenchymal Cells (Ltd.) 共培养时，观察到 LTC-IC 集落数量显着增加。换句话说，间充质细胞中表达的两种膜（糖）蛋白 mKirre 和 Tmtsp 被证明具有支持造血的能力。另一方面，在与强烈表达该基因的非间充质细胞共培养时，没有观察到造血支持能力的增加，这表明间充质特异性膜因子对于造血支持至关重要。此外，我们目前正在研究它是否具有扩增未成熟SP细胞（据说是真正的造血干细胞）的能力。

项目成果

ヒスタミンH_1受容体の細胞内移行と薬物感受性変化

组胺H_1受体的内化与药物敏感性的变化

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日薬理誌 125
• 作者: 菱沼 滋;齋藤政樹
• 通讯作者: 齋藤政樹

Augmentation of_<-1>-adrenoceptor-mediated contraction by warming without increased phosphorylation of myosin in rat caudal arterial smooth muscle.

通过升温增强_ -1 -肾上腺素受体介导的收缩而不增加大鼠尾部动脉平滑肌中肌球蛋白的磷酸化。

• 发表时间: 2005
• 期刊: J.Pharmacol.Sci. 99
• 作者: Mita;M.;Walsh;M.P.;Saito;M.
• 通讯作者: M.

Substitution of the N-glycan function in glycosyltransfer- ases by specific amino acids : ST3Gal-V as a model enzyme.

用特定氨基酸取代糖基转移酶中的 N-聚糖功能：ST3Gal-V 作为模型酶。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Glycobiology 16(3)
• 作者: Uemura;S.;Saito;M.;Inokuchi;J.;et al.
• 通讯作者: et al.

Binding of Clostridium botulinum Type C and D Neurotoxins to Ganglioside and Phospholipid : Novel insights into the receptor for clostridial neurotoxins

C 型和 D 型肉毒梭菌神经毒素与神经节苷脂和磷脂的结合：对梭菌神经毒素受体的新见解

• 发表时间: 2005
• 期刊: J.Biol.Chem. 280(42)
• 作者: Tsukamoto;K.;Saito;M.;Kozaki;S.;et al.
• 通讯作者: et al.

Differential Development of Carbachol-Induced Desensitiz- ation in Receptor-Mediated Ca2+ Influx and Ca2+ Release Pathways in Smooth Muscle of Guinea-Pig Taenia Caeci.

豚鼠平滑肌中受体介导的 Ca2 流入和 Ca2 释放途径中卡巴胆碱诱导的脱敏的差异发展。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Clin.Exp.Pharmacol.Physiol. 34
• 作者: Hishinuma;S.;Matsumoto;Y.;Sato;R.;Saito,M.
• 通讯作者: Saito,M.