マイクロ遺伝子重合法を用いた人工バイオシグナル分子創出系の確立

利用微基因聚合方法建立人工生物信号分子产生系统

基本信息

批准号：
10878115
负责人：
芝清隆
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Japanese Foundation For Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

既存の遺伝子に依存しないで、自由に機能性タンパク質を試験管の中で人工創出する実験系を開発している。2年間の本研究では特に、「新しいバイオシグナル分子としての人工タンパク質を自由に創り出す系を確立する」ことを目標として、11年度の研究では、(1)人工タンパク質を固定したニトロセルロース膜を用いた細胞接着スクリーニング系の確立、(2)ニトロセルロース膜を利用しない人工タンパク質の細胞接着活性測定系の構築、の2つを目標とした。(1)では、精製した人工タンパク質をニトロセルロース膜にスポット固定し、培養細胞(Sf-9)と、室温で2時間インキュベート後、洗浄し、細胞をアミドブラック染色することにより、細胞接着活性を示す人工タンパク質を選択することが可能となった。この手法を用いることにより、20種の人工タンパク質の中で、1種(#331)が細胞接着活性を持つことが明らかとなった。この#331人工タンパク質を用いることにより、アガロースビーズを利用した、細胞接着活性測定系をさらに構築した。これは、#331人工タンパク質のN末に存在するポリヒスチジントラクトを特異的に結合する、NTAアガロースビーズを利用することにより、アガロースビーズの表面に#331人工タンパク質をコートし、これを培養細胞(Sf-9)とインキュベートすることから、細胞をアガロースビーズの表面に吸着させる方法である。磁気金属の封入されたNTAアガローズビーズを利用することにより、迅速に非特異的結合細胞を洗浄できる系も構築することに成功した。これらの2つの技術を利用することから、今後、大規模な細胞接着活性を持つ新しいバイオシグナル分子としての人工タンパク質をスクリーニングすることが可能となった。

我们正在开发实验系统，使我们能够在不依赖现有基因的情况下自由地在测试管中创建功能蛋白。在这项为期两年的研究中，目标是“建立一个自由创建人造蛋白作为新的生物信号分子的系统”，2011年的研究针对两项：（1）使用硝基纤维素膜使用固定化的人工蛋白质，以及（2）建立人造蛋白质的人造蛋白质，建立一个细胞粘附筛选系统膜。在（1）中，将纯化的人造蛋白固定在硝酸纤维素膜上，并在室温下与培养的细胞（SF-9）一起孵育2小时，然后洗涤，然后用酰胺黑色染色，以选择具有细胞粘附活性的人造蛋白质。通过使用此技术，可以发现20种人造蛋白（＃331）具有细胞粘附活性。通过使用这种＃331人造蛋白，进一步构建了使用琼脂糖珠的细胞粘附活性测量系统。这是一种通过利用NTA琼脂糖珠在＃331人造蛋白质的N末端结合的NTA琼脂糖珠来吸附细胞表面上的细胞的方法，并将细胞与＃331人造蛋白质覆盖，并与培养的细胞孵育（SF-9）。通过利用用磁力封装的NTA琼脂糖珠，我们还成功构建了一个允许快速洗涤非特异性结合细胞的系统。通过利用这两种技术，将来可以筛选人造蛋白作为具有大规模细胞粘附活性的新生物信号分子。