組織の線維化の分子細胞生物学的研究

组织纤维化的分子细胞生物学研究

基本信息

批准号：
10877362
负责人：
入村達郎
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

結合組織の病的変化である組織の線維化の機構を解明することが本研究の最終目的である。具体的には、線維化の機構の第一段階は、線維芽細胞が移動して集積することであるとの仮説に基づき、このプロセスの引き金となる分子の同定を目指した。また繊維化の起こり方が臓器によって異なる原因を追求するための基礎を固めるため、種々の臓器から繊維芽細胞細胞を分離して培養し、それらの差異について検討した。上皮系の細胞由来で蛋白性の、線維芽細胞遊走因子をcolon38細胞の培養上清中に見いだしたので、この可溶性因子の精製、蛋白の同定とcDNAの獲得を目指した。逆相HPLC、疎水性クロマトグラフイー、ゲル浸透HPLC等によって分画し、マウス線維芽細胞の走化性をボイデンチャンバー法にて測定することによって生物活性の指標とした。分子量二十数万の熱安定性の分子が活性の本体であることが明かとなった。抗体によるウエスタンブロッティング、阻害実験などから、この蛋白がフィブロネクチンおよびその断片である可能性が高い事が判明した。一方、in vivoでこの因子が作用して、組織の線維化が起こることを証明することを目指して、colon38細胞から限界希釈法によって8種のクローンを得た。これらの培養上清を、活性測定に供し他ところ活性因子を放出しているものとそうでないものとが見い出された。一方同系マウス(C57BL/6)にこれらのクローンを移植して、それらの造腫瘍性、転移性、線維化の状態を観察した。画像解析装置によって繊維化を定量する試みに最近着手したので、近い将来に活性因子の存在と繊維化の関係が明確になるはずである。各種臓器由来の繊維芽細胞に関しては、肝臓、腹腔、及び皮膚由来のものは、比較的容易に再現性良く得ることができるようになった。これらの表面糖蛋白の解析を行ったが、大きな差異は見られず、これらが類似した細胞であることを支持した。一方これらの細胞の培養上清のマウスの種々の癌細胞に対する走化性を比較するとそれぞれにユニークな特異性が見られ、繊維芽細胞は機能的に多様であることが明かとなった。

这项研究的最终目标是阐明组织纤维化的机理，这是结缔组织的病理变化。具体而言，我们的目的是基于以下假设，即成纤维细胞机理的第一步是成纤维细胞的迁移和积累。此外，为了巩固追求因器官到器官不同的原因的基础，将成纤维细胞与各种器官分离并培养，并检查了它们之间的差异。在结肠38细胞的培养上清液中发现了源自上皮细胞的蛋白质成纤维细胞迁移因子，其目的是净化该可溶性因子，鉴定蛋白质并获得cDNA。通过相反的相HPLC，疏水色谱，凝胶渗透HPLC等分离细胞，并使用Boyden腔室方法测量小鼠成纤维细胞的趋化性，以形成生物学活性的指标。已经揭示了分子量超过200,000的热稳定分子是活性体。用抗体，抑制实验等蛋白质印迹表明，该蛋白很可能是纤连蛋白及其片段。同时，通过限制稀释，从Colon38细胞中获得了八个克隆，目的是证明该因子在体内和组织纤维化发生。这些培养的上清液进行了活动测量，发现它们具有并且没有释放活跃因素。另一方面，将这些克隆植入合元小鼠（C57BL/6），并观察到它们的肿瘤，转移和纤维化态。由于我们最近开始尝试使用图像分析设备来量化纤维化，因此在不久的将来应明确活动因素与光纤之间的关系。关于源自各种器官，肝脏，腹膜腔和皮肤的成纤维细胞，可以具有相对简单且可重复的特性。对这些表面糖蛋白进行了分析，但没有发现显着差异，证明它们是相似的细胞。另一方面，当比较这些细胞的培养上清液的趋化特性与小鼠的各种癌细胞时，每种细胞都揭示了独特的特异性，表明成纤维细胞在功能上是多样的。