食道癌に関与する未知なる遺伝子の同定とその構造及び機能の解明

食管癌未知基因的鉴定及其结构和功能的阐明

• 批准号: 10877198
• 负责人: 橋本 修
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877198/
• 关键词: 食道癌; ゲノムスキャンニング; RLGS法; クローニング; RLGS; ゲノム解析; 未知遺伝子

食道癌(扁平上皮癌)の遺伝子変化を、ゲノムDNAを2次元電気泳動して解析するRestriction landmark genomic scanning法(RLGS法)を用いて、検討している。食道癌の新鮮手術材料(5症例)の癌部、非癌部組織を採取し、ゲノムDNAを抽出後、RLGS法を施行した。オートラジオグラフィーで得られたprofileをデジタル化し、約1000のスポット化されたDNA断片を癌部、非癌部間で比較した。症例数がまだ少ないものの、癌部のみに出現するスポット変化を2箇所みとめた。これらのスポット変化と,臨床病理学所見との関連性を様々な角度から解析,検討している段階である。スポット変化のうち,1箇所に対しては,既にクローニングを施行済みである。その際、制限酵素NotI切除断端のみを描出し,他の切除断端からなる遺伝子断片を除去するNot I trapper methodを用いている。クローニングは、trapper施行後のprofileから、目的とするスポットを直接打抜き、DNAを抽出した。DNA量の確保のため、プラスミドに挿入し、大腸菌を用いて形質転換を行い、増幅させた。さらにダイデオキシ法にて、塩基配列を決定した。本遺伝子断片と他遺伝子との相同性の検索では、特記すべき相同性は認めなかったものの、本遺伝子断片をプローブとして、さらなる解折が可能と思われた。さらに,本遺伝子断片の塩基配列よりプライマーを作成し,PCRによる脱メチル化の変化を微小病変やパラフィン切片からも検出し得るため,これを計画している。この方法にて,検索症例数を増加させれば,臨床病理学的所見との関連性が明らかになる可能性が考えられる。また,今後はRLGS profi1e数とスポットクローニング数の増加も目標にしたいと考えている。

我们正在使用限制性标志基因组扫描方法（RLGS 方法）研究食道癌（鳞状细胞癌）的遗传变化，该方法通过二维电泳分析基因组 DNA。收集新鲜食管癌手术标本（5例）的癌组织和非癌组织，提取基因组DNA，并进行RLGS方法。将放射自显影获得的图谱数字化，并对癌性区域和非癌性区域的约 1000 个斑点 DNA 片段进行比较。尽管病例数仍然很少，但我们观察到仅在癌变区域出现的两个斑点变化。我们目前正处于从多个角度分析和检验这些斑点变化与临床病理结果之间关系的阶段。克隆已针对一处变化进行。此时，我们使用Not I trapper方法，该方法仅可视化限制性内切酶NotI切割边缘，并去除由其他切割边缘组成的基因片段。对于克隆，在应用捕获剂后，通过直接从轮廓上冲出目标点来提取 DNA。为了确保DNA的量，将其插入质粒中，使用大肠杆菌进行转化并扩增。此外，使用双脱氧法确定碱基序列。虽然在寻找该基因片段与其他基因之间的同源性时没有发现值得注意的同源性，但人们认为使用该基因片段作为探针进行进一步的分析是可能的。此外，我们计划根据该基因片段的核苷酸序列创建引物，以便通过PCR从微小病变和石蜡切片中检测去甲基化的变化。如果使用这种方法增加检索病例的数量，则有可能揭示与临床病理结果的关系。未来，我们还希望增加 RLGS 配置文件和点克隆的数量。