CBPの統合的転写制御機構の解析

CBP整合转录调控机制分析

基本信息

批准号：
10173202
负责人：
深水昭吉
金额：
$ 1.28万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らは,哺乳類由来のCBPの108個のアミノ酸から構成されるC/H1領域に細胞特異的な強い転写活性化能があり,リガンドが不明な核内レセプターであるHNF4や最近注目を集めている接着因子であるβ-カテニンが,CBPと結合して転写を活性化することを見出してきた.さらに,CBPのコアクチベーター機能にRNAヘリケースA(RHA)を仲介とするcore RNA polymerase IIとの複合体形成が必要不可欠であることを報告してきた.そこで本研究は,以下の3点に焦点を絞りCBPの統合的転写制御機構を明らかにすることを目的とする.《1》新規結合因子群の解析全長cDNAのクローニング:STAT2の全長cDNAをクローン化した結果,現在まで報告されているものとは違ったスプライシングが生じており,8アミノ酸残基からなる繰り返し配列が12回連続していた.《2》 RHA結合因子群の探索と解析Yeast two hybrid systemを用いてスクリーニングを行い,結合分子を同定する.そのため,RHAの4分割した機能ドメインをTrp選択マーカー遺伝子を持ちGal1のプロモーターの下流に組み込まれたGal4のDNA binding domainに接続しbait plasmidを構築した.イーストY190に一Trpで形質転換して,bait yeastを作製する.その後,cDNA library(マウス胎児,ヒト腎臓,及びマウス肝臓)をbait yeastに-Trp/-Leu/-Hisで形質転換して,約2週間培養後β-galによるフィルターアッセイを行いpositive cloneを選択しクローン化した結果,多くのポジティブクローンを得た.現在解析中である.《3》転写活性化ドメインの個体レベルにおける機能的役割の解析普遍的に働くプロモーター(CMV-IE enhancer/chicken β-actin promoter-pCAGGS:東北大学加齢医学研究所・宮崎純一先生より供与)に転写活性化最小ドメイン(コザック配列を持つMetを付加)を接続した導入遺伝子を持つ,4系統のマウスを作製した.これらからホモ接合体を確立して,導入遺伝子の発現部位やそこでの表現型を見た結果,狭空間においてスピンするマウスや顎下腺に腫瘍を生じる系統が見出された.現在詳しく解析中である.

申请人发现，由108个哺乳动物CBP的氨基酸组成的C/H1区具有强细胞特异性转录激活势，而HNF4（HNF4）是其配体未知的核受体，最近吸引了注意力粘附因子β-蛋白β-蛋白与CBP结合并激活转录。此外，他们报告说，由RNA解旋酶A（RHA）介导的核心RNA聚合酶II的复合形成对于CBP的共激活函数至关重要。这项研究的重点是以下三点，旨在阐明CBP的综合转录调控机制。对全长cDNA的新结合因子组克隆分析：STAT2的全长cDNA被克隆，从而产生与迄今为止报告的剪接不同的剪接，其中12个连续的重复序列为8个氨基酸残基。 2。搜索和分析RHA结合因子。使用酵母两个杂交系统进行筛选以鉴定结合分子。因此，RHA的四部分功能结构域与GAL4的DNA结合结构域连接，该结合结构域具有TRP可选标记基因，并在GAL1启动子的下游集成，并构建了诱饵质粒。用一个TRP转变为酵母Y190，并用诱饵酵母转变为酵母。之后，cDNA文库（小鼠胎儿，人肾脏和小鼠肝脏）是诱饵。用-trp/-leu/-His转化酵母，然后使用β-gal进行过滤测定，在培养约2周后，选择了一个阳性克隆并克隆了一个阳性克隆，获得了许多阳性克隆。目前正在分析。 3 Analysis of the functional role of the transcriptional activation domain at the individual level Four mice have been created with a transgene that has a universally active promoter (CMV-IE enhancer/chicken β-actin promoter-pCAGGS: donated by Professor Miyazaki Junichi of the Institute of Aging Medicine, Tohoku University) with a minimal transcriptional activation domain (added by Met with the Kozak sequence) was 用过的。建立了纯合体，并且由于观察了转基因表达的位点和那里的表型，该线在狭窄空间和下颌腺体中旋转的小鼠中产生肿瘤。目前正在详细分析中。