蛍光プローブによるCa^<2+>放出チャネルタンパク質の機能分担の解明

使用荧光探针阐明 Ca^2+ 释放通道蛋白的功能划分

• 批准号: 10169256
• 负责人: 村山 尚
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10169256/
• 关键词: カルシウムチャネル; 蛍光プローブ; リアノジン受容体; イノシトール3リン酸受容体

細胞内Ca^<2+>ストアは筋収縮や神経伝達,脳の高次機能といった様々な細胞機能に重要な役割を果たしていることが明らかになっている.本研究では細胞内Ca^<2+>ストアに存在するCa^<2+>放出チャネルであるイノシトール3リン酸受容体(IP3R)およびリアノジン受容体(RyR)を生きた細胞内で可視化しその細胞内局在を調べ,細胞内Ca^<2+>濃度変化との同時測定によりこれらのCa^<2+>放出チャネルの役割を明らかにすることを試みた.可視化の方法としてはそれぞれのタンパク質に対する特異的な抗体を作製し,これに蛍光プローブをつけて細胞内に導入することとした.本年度はこの実験の最初の段階である特異的な抗体の作製と蛍光プローブ標識を行った.抗体はIP3RおよびRyRの一次構造の比較から特異的な部位を選んでその部分配列をペプチド合成し,これをウサギに免疫してポリクローナル抗体として得た.現在までにRyRに対しては全てのサブタイプを認識するものおよび各サブタイプ(RyR1-3)特異的な抗体がそれぞれ得られている.これらの抗体は精製後,励起波長の異なる蛍光色素(Cy2,Cy3,Cy5)でそれぞれ標識した。ウエスタンブロットおよび蛍光抗体法により蛍光標識が良好に導入されたことが確認された.同時に,抗体遺伝子をSigle chain Fv fragmentとして細胞内に発現させることも試みた.可視化の方法としてはクラゲの蛍光タンパク質であるgreen fluorescent protein(GFP)との融合タンパク質として発現させる方法を用いた.RyRに対するポリクローナル抗体が作製されたアミノ酸配列をマウスに免疫し,これらマウスのB細胞のcDNAライブラリよりスクリーニングを行った.現在までに一次スクリーニングでそれぞれ数個のポジティブなクローンが得られておりさらにクローニングを進めている段階である.

已经揭示了细胞内Ca^<2+>商店在各种细胞功能中起重要作用，例如肌肉收缩，神经传递和较高的脑功能。在这项研究中，肌醇3-磷酸受体（IP3R）和ryanodine受体（RYR）是Ca^<2+>释放通道中存在于细胞内Ca^<2+>存储中的释放通道，并且在活细胞中检查了细胞内定位，我们试图阐明这些CA^<2+ earlion> reakere> bequient <2+abey> bequient <2+> rake> bequient in sensult ca bysult ca的作用。作为一种可视化方法，我们为每种蛋白质创建了特定的抗体。用荧光探针产生并引入抗体并引入细胞。今年，该实验的第一步是产生特定的抗体并标记荧光探针。从IP3R和RYR的一级结构的比较中选择抗体，部分序列是通过肽合成的，肽通过兔子免疫以获得多克隆抗体。迄今为止，已经获得了每个亚型（RYR1-3）的RYR和抗体的所有亚型。纯化后，将这些抗体用具有不同激发波长的荧光染料（CY2，CY3，CY5）标记。 Western印迹和免疫荧光证实了荧光标记已很好地引入。同时，我们还试图将抗体基因表达为细胞中的Sigle链FV片段。一种可视化方法被用来表达与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，这是果冻的荧光蛋白。对其中产生了针对RYR的多克隆抗体的氨基酸序列对小鼠免疫，并从这些B细胞的cDNA文库中进行筛选。迄今为止，已经通过初级筛选获得了几个积极的克隆，并且克隆正在进一步发展。

项目成果

村山 尚: "続心臓代謝実験法,II受容体に関する実験 (Ryanodine receptor)" 六法出版社,東京, 101-107 (1998)

Takashi Murayama：“继续心脏代谢实验方法，II受体（Ryanodine受体）的实验”Rokupo Publishing，东京，101-107（1998）