血小板活性化因子受容体の構造と機能

血小板活化因子受体的结构与功能

基本信息

批准号：
08670136
负责人：
和泉孝志
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670136/
关键词：
PAF受容体変異体リガンド結合部位

项目摘要

血小板活性化因子(platelet-activating factor、以下PAF)は生理活性脂質の1つで、種々の病態、アレルギー反応、免疫反応に関与し、多彩な生物活性を持っている。PAF受容体遺伝子はGタンパク質を介する7回膜貫通型の受容体である。本研究では、変異PAF受容体遺伝子を導入した哺乳動物の細胞系を用いて膜貫通部位におけるリガンド結合部位の検索を行った。膜貫通部位に存在し、ヒト、モルモット、ラット、マウス間で保存されている荷電をもつ23個の極性アミノ酸残基をアラニンに転換したモルモットPAF受容体の変異体を作成し、Cos-7細胞に一過性に発現させてリガンド([^3H]PAF)および拮抗剤([^3H]WEB2086)の結合を調べた。拮抗剤に対する結合には大きな変化はなかったが、第2および第3膜貫通部位の変異体はPAFが結合しやすく第5、第6、第7膜貫通部位の変異体はPAF結合が減少していた。次に大きくPAF結合が変化した変異体をCHO細胞に安定的に発現させ、リガンド結合およびPAFによる細胞内情報伝達を検索した。PAF結合の増加した変異体N100A,T101A,S104AではPAFに対する親和性の増加と、より低濃度での細胞内情報伝達系の活性化が認められ、中でもN100Aは構成的に活性化したPAF受容体であることが判明した。PAF結合の減少した変異体H100A,H248A,Q276AをCHO細胞に安定的に発現させたところリガンド結合および細胞内情報伝達いずれも減少していた。さらにH188,H248,H249の3つのヒスチジン残基はPAFのリン酸残基の結合に関与し、水分子とあわせて亜鉛イオンの結合部位を形成している可能性が示唆された。これらの結果を元にPAF受容体の膜貫通部位の3次元立体モデルを作製し、PAFの結合様式を提唱した。

血小板激活因子（PAF）是一种生理活性的脂质，参与了多种病理状况，过敏反应和免疫反应，并且具有多种生物学活性。 PAF受体基因是由G蛋白介导的七跨膜受体。在这项研究中，我们使用了一个哺乳动物细胞系，引入了突变的PAF受体基因来搜索跨膜部位的配体结合位点。 A mutant of the guinea pig PAF receptor was created in which 23 charged polar amino acid residues that were present at the transmembrane site and were conserved between humans, guinea pigs, rats and mice were converted to alanine, and was transiently expressed in Cos-7 cells to examine binding of the ligand ([^3H]PAF) and antagonist ([^3H]WEB2086).与拮抗剂的结合没有显着变化，但是第二和第三跨膜位点的突变体倾向于在第五，第六和第七跨膜位点容易结合PAF与突变体结合，并降低了PAF结合。接下来，在CHO细胞中稳定表达具有较大PAF结合的突变体，并搜索配体结合和细胞内信号传导。 PAF结合增加的突变体N100A，T101A和S104A显示出对PAF的亲和力增加，并且在较低浓度下的细胞内信号传导系统激活，并且发现N100A是组成型激活的PAF受体。在CHO细胞中稳定地表达了具有降低PAF结合的突变体H100A，H248A和Q276a，并降低了配体结合和细胞内信号传导。此外，建议三个组氨酸残基H188，H248和H249参与PAF中磷酸盐残基的结合，并与水分子一起，它们可能形成锌离子的结合位点。基于这些结果，我们创建了PAF受体的跨膜位点的三维立体声模型，并提出了PAF的结合模式。