卵成熟誘起ステロイドホルモン膜受容体遺伝子のクローニング

卵母细胞成熟诱导类固醇激素膜受体基因的克隆

• 批准号: 08640851
• 负责人: 吉国 通庸
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08640851/
• 关键词: 卵成熟; ステロイドホルモン; ホルモン受容体; G蛋白質; メダカ

魚類の卵成熟誘起ステロイドホルモン細胞膜受容体のクロマトグラフィー法による精製法の基本手法を確立した。また、親和性クロマトグラフィー法へ応用するために、卵細胞膜上でこの受容体と強く相互作用していると考えられるGTP結合タンパク質のサブタイプを特定し、その遺伝子の全長のクローニングに成功した。コイ卵母細胞の卵細胞膜画分から、0.2%シュークロースモノラウレートにより受容体を可溶化後、イオン交換、ヒドロキシアパタイト1、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイト2の各クロマトグラフィーにより受容体の純度を相当程度高めることが出来たが、完全な精製には不十分であった。より、効果的な分離原理を導入するために、受容体と結合している百日咳毒素感受性GTPタンパク質(Gi)のサブタイプの同定を行った。材料には、特定の発達段階にある卵母細胞の単離が容易であるメダカを用いた。メダカ卵母細胞で発現しているGiはGi1およびGi2であることをRT-PCR法で確認した。このことから、卵成熟誘起ホルモン受容体と結合しているGiのサブタイプは、Gi1およびGi2であることが明らかとなった。次に、これらGi1、Gi2の遺伝子をクローニングした。それぞれ354,355のアミノ酸から成り、ラットのGi1とGi2に対して94%、85%と高い相同性を示した。魚類のGTP結合タンパク質のクローニングは世界で始めてである。翻訳したアミノ酸配列をもとに合成したペプチドを用いウサギに免疫し、Gi1とGi2にそれぞれ特異的なポリクローナル抗体を作成した。次に、メダカ卵細胞膜から可溶化したホルモン受容体が、作成したポリクローナル抗体を用いることでメダカGiと共に免疫沈降法で回収されることが明らかとなった。(本結果は、現在、国際誌に投稿中である。)以上、本研究において、魚類卵成熟誘起ホルモン受容体の精製とクローニングに重要な知見が得られた。

鱼 - 成熟的类固醇类固醇类固醇激素细胞膜受体通过色谱法建立了纯化方法的基本方法。另外，为了应用兼容色谱法，指定了GTP结合的蛋白质亚型（被认为与该受体在卵细胞膜上强烈相互作用），并得到了指定，并成功地克隆了基因的总长度。从鲤鱼样细胞的鸡蛋细胞膜中，受体通过0.2％的环酸盐溶液，离子置换后，羟pat虫1，凝胶过滤，羟pate patite 2色谱，受体纯度是可观的。增强它，但不足以完全纯化。为了引入有效的分离原理，鉴定出扰动GTP蛋白（GI）与受体结合的亚型。该材料是Medaka，在特定的发育阶段易于在卵细胞中分离。 RT-PCR方法证实了在Medaka卵中表达的GIS为GI1和GI2。这表明与卵成熟激素受体结合的GI亚型是GI1和GI2。接下来，将这些GI1和GI2基因克隆。它分别由354,355个氨基酸组成，大鼠GI1和GI2显示94％和85％。 Fish GTP结合蛋白克隆是世界上第一个。使用基于翻译的氨基酸序列合成的肽制成的肽对兔子进行了免疫力，并在GI1和GI2中产生了特定的多克隆抗体。接下来，揭示了通过使用Medaka GI产生的多克隆抗体，Medaka GI收集了从Medaka卵细胞膜中溶解的激素受体。 （目前，该结果已发布在国际杂志上。）在这项研究中，我们获得了纯化和克隆鱼卵的荷尔蒙受体的重要知识。