分子進化的手法による高性能な蛍光免疫センサーQuenchbody構築法の確立

利用分子进化方法建立高性能荧光免疫传感器Quenchbody构建方法

• 批准号: 22KJ1271
• 负责人: 井上 暁人
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1271/
• 关键词: バイオテクノロジー; タンパク質工学; 抗体工学; ケミカルバイオロジー; 分子進化; 蛍光; 酵母提示系; 免疫測定

1. 酵母提示抗体ライブラリを用いた高性能なQ-body選択研究協力者である徳島大学村上博士より分与を受けた30種余りのヒト血清アルブミン結合ナノ抗体を材料に，これらをコイルドコイル形成ペプチドE4と融合して酵母細胞表面で提示させ，外部からFITC-TAMRA標識コイルドコイル形成ペプチドK4を付加してQ-body化し，抗原応答の高いQ-bodyを選択した。この結果得られた，抗原依存的蛍光応答の高いクローンは，大腸菌で発現させてQ-body化しても他のクローンより高い応答を示した。さらに酵母表面やビーズ上で蛍光応答が向上することが新たにわかり、これらの本研究成果をまとめて論文発表を行った(Sci. Rep.)。2. ランダムなトリプトファン残基挿入によるQ-body応答の向上1で選択されたナノ抗体をテンプレートとし、その超可変領域(CDR)のチロシン残基にトリプトファン残基をランダムに導入したライブラリから抗原結合能を示し、かつクエンチを示すナノ抗体を選択した。その結果、複数のトリプトファン残基を含む変異体が獲得された。さらに選択された変異体を大腸菌で発現させ、蛍光応答を見ると抗原結合を損なうことなく、より高い応答を示すことが確認され、本手法を用いてナノ抗体を材料としたQ-bodyを分子進化させることに成功した。3. 低分子認識VHHのQ-body応答の向上低分子認識ナノ抗体としてはコルチゾールを認識するナノ抗体を新たなモデルとし、立体構造をもとにCDR1にトリプトファン残基の変異を導入した。その結果、野生型と比べて約2倍の蛍光応答を示すことが確認され、低分子認識ナノ抗体についても分子進化が可能であることが示唆された。

1. 使用酵母展示抗体库进行高性能 Q-body 选择 我们使用研究合作者德岛大学 Murakami 博士提供的 30 多种人血清白蛋白结合纳米抗体，将其合成为卷曲螺旋形成肽与E4融合并展示在酵母细胞表面，外部添加FITC-TAMRA标记的卷曲螺旋形成肽K4形成Q体，筛选出抗原应答高的Q体。由此产生的具有高抗原依赖性荧光响应的克隆，即使在大肠杆菌中表达并转化为 Q-body 时，也比其他克隆表现出更高的响应。此外，我们新发现酵母表面和珠子的荧光响应得到改善，并发表了一篇总结这些研究结果的论文（Sci. Rep.）。 2.通过插入随机色氨酸残基改善Q-body反应使用1中选择的纳米抗体作为模板，从我们选择的高变区（CDR）的酪氨酸残基中随机引入色氨酸残基的文库实现抗原结合。显示出能力和猝灭能力的纳米抗体。结果，获得含有多个色氨酸残基的突变体。此外，当选择的突变体在大肠杆菌中表达并观察到荧光响应时，证实它们显示出更高的响应，并且成功地进化了抗原结合。 3.改善小分子识别VHH的Q-body反应我们使用识别皮质醇的纳米抗体作为小分子识别纳米抗体的新模型，并根据其3D结构在CDR1中引入色氨酸残基突变。结果证实，荧光响应约为野生型的两倍，表明小分子识别纳米抗体的分子进化也是可能的。

项目成果

Creation of a Nanobody-Based Fluorescent Immunosensor Mini Q-body for Rapid Signal-On Detection of Small Hapten Methotrexate.

• DOI: 10.1021/acssensors.0c01404
• 发表时间: 2020-11-10
• 期刊: ACS sensors
• 影响因子: 8.9
• 作者: Akihito Inoue;Y. Ohmuro;T. Kitaguchi;H. Ueda
• 通讯作者: H. Ueda

Rapid construction of fluorescence quenching-based immunosensor Q-bodies using α-helical coiled-coil peptides

使用 α 螺旋卷曲螺旋肽快速构建基于荧光猝灭的免疫传感器 Q 体

• DOI: 10.1039/d1cc02605d
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 4.9
• 作者: Yasuda Takanobu;Inoue Akihito;Kitaguchi Tetsuya;Ueda Hiroshi
• 通讯作者: Ueda Hiroshi

Construction of mini Q-body using the nanobody to detect chemotherapy agent

使用纳米抗体构建迷你Q-body来检测化疗药物

• 发表时间: 2021
• 作者: Inoue A.; Ohmuro Y.; Kitaguchi T.; Ueda H.
• 通讯作者: Ueda H.

Evaluation and selection of potent fluorescent immunosensors by combining fluorescent peptide and nanobodies displayed on yeast surface

通过结合荧光肽和酵母表面展示的纳米抗体来评估和选择有效的荧光免疫传感器

• DOI: 10.1038/s41598-021-02022-7
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 4.6
• 作者: Inoue Akihito;Yasuda Takanobu;Zhu Bo;Kitaguchi Tetsuya;Murakami Akikazu;Ueda Hiroshi
• 通讯作者: Ueda Hiroshi

酵母細胞表層提示系を用いた抗ヒト血清アルブミン(HSA) ナノ抗体由来“mini Q-body”の選択

利用酵母细胞表面展示系统筛选抗人血清白蛋白（HSA）纳米抗体衍生的“迷你Q体”

• 发表时间: 2021
• 作者: 井上暁人; 安田貴信; 北口哲也; 村上明一; 上田宏
• 通讯作者: 上田宏