脱ユビキチン化酵素の切断モチーフを利用したタンパク質発現制御法の開発とその応用

去泛素化酶剪切基序蛋白表达控制方法的建立及其应用

• 批准号: 22KJ0416
• 负责人: 宇津木 優樹
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0416/
• 关键词: デグロン; 脱ユビキチン化酵素; ユビキチン

本研究では、デグロンと標的タンパク質の間に、細胞内の脱ユビキチン化酵素によって切断される基質配列を挿入することで、低分子化合物を添加し、デグロン融合タンパク質が安定化された後、細胞内の脱ユビキチン化酵素の活性により、標的タンパク質からデグロンを切り離すシステムを構築する。発現制御法としての基本的性能を明らかにするとともに、ゲノム編集技術を用いて、内在性タンパク質の発現制御への適用を目指す。令和４年度は、本デグロンシステムにより、内在的に発現するタンパク質の存在量を制御することが可能であるかを検討するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を用いて、標的タンパク質ｃ－ＳｒｃのＮ末端にデグロンおよび切断基質配列を挿入した。Ｐ２Ａ配列上流に接続したｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子と、デグロンおよび切断基質配列を標的領域に相同な配列で挟んだ遺伝子を含むドナープラスミドを、標的遺伝子に対するガイドＲＮＡの鋳型となる遺伝子配列を含んだＣａｓ９発現ベクターとともに、ヒト１倍体細胞であるＨＡＰ１細胞に遺伝子導入した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる導入細胞の薬剤選択後、シングルセルクローニングを行い、ＰＣＲによるジェノタイピングにより、ノックインを確認した。さらに、ウエスタンブロットにより、デグロンと切断基質配列を付加した内在性ｃ－Ｓｒｃが、化合物添加時に、安定化され、ｃ－Ｓｒｃからデグロンが切り離されることを確認した。

在这项研究中，我们通过插入由细胞内去泛素酶切割的底物序列，在降解决定子和目标蛋白之间添加了低分子量化合物，并在稳定降解决定子融合蛋白后，将其插入到细胞中。一种利用去泛素化酶的活性将降解决定子与靶蛋白分离的系统。除了阐明其作为表达控制方法的基本性能外，我们的目标是应用基因组编辑技术来控制内源蛋白的表达。在2020财年，我们将使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术来检查是否可以使用该降解决定子系统来控制内源表达蛋白质的丰度。在 的N末端插入降解决定子和切割底物序列。含有连接在P2A序列上游的嘌呤霉素抗性基因的供体质粒，其中降解决定子和切割底物序列夹在与靶区域同源的序列之间的基因，以及含有作为模板的基因序列的Cas9表达载体同时，将该基因导入HAP1细胞，即人类单倍体细胞。使用嘌呤霉素对导入的细胞进行药物选择后，进行单细胞克隆，并通过PCR进行基因分型来确认敲入。此外，通过Western印迹证实，添加了降解决定子和切割底物序列的内源性c-Src在添加化合物后稳定，并且降解决定子从c-Src切割。

项目成果

Rapid and tunable drug control of protein levels in native or near-native form

对天然或接近天然形式的蛋白质水平进行快速且可调节的药物控制

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuki Utsugi;Yusaku Miyamae
• 通讯作者: Yusaku Miyamae

An excisable degron system for conditional control of protein stability without loss-of-function

一种可切除的降解决定子系统，用于在不丧失功能的情况下条件控制蛋白质稳定性

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuki Utsugi;Yusaku Miyamae
• 通讯作者: Yusaku Miyamae

A method for conditional control of cellular protein stability using an excisable degron tag

使用可切除降解决定子标签条件控制细胞蛋白质稳定性的方法

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuki Utsugi;Yusaku Miyamae
• 通讯作者: Yusaku Miyamae