横紋筋リボソームの破綻が引き起こす心機能不全の分子機構の解明

阐明横纹肌核糖体破坏引起心功能障碍的分子机制

• 批准号: 22K19531
• 负责人: 松本 有樹修
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19531/
• 关键词: 横紋筋リボソーム; 拡張型心筋症; Ribo-seq; リボソーム; 心臓

われわれは、横紋筋にはRPL3を含む「構成型リボソーム」とRPL3Lを含む「横紋筋リボソーム」の両方が存在することを見出した。さらに、RPL3L KOマウス（= 横紋筋リボソームを欠損）は心臓の収縮能の低下を示し、心臓の収縮に関与する遺伝子など一部の遺伝子で翻訳活性が低下することをRibo-seq解析により見出していた。そこで、本課題では「構成型リボソーム」と「横紋筋リボソーム」にどのような質的な違いがあるかを明らかにしていくことを目標としている。【1】RPL3L KOマウスの心臓の経時的観察と病理学的解析：これまでに12週齢のRPL3L KOマウスにおいて、有意に心臓の収縮能の低下が観察されているため、老化によりさらに症状が悪化するかを検討するために、１０ヶ月齢のマウスなども用いて解析を行ったが、さらなる症状の悪化は観察されなかった。また心臓の圧負荷などを行っても、さらなる悪化は見られなかった。【2】タグノックインマウスを作製して標的mRNAに違いがないかを検討する：RPL3もしくはRPL3LにHAタグ配列をノックインしたマウスを作製した。さらに、ノックインマウスの心臓のサンプルを用いてHAタグ抗体の免疫沈降で精製し、IP-Ribo-seqなどを行なった。RPL3L-HAのIP-Ribo-seqでは心臓の収縮にかかわる遺伝子などが、RPL3-HAと比較してより濃縮されていた。【3】クライオ電子顕微鏡解析により構造基盤を明らかにする：横紋筋リボソームの構造をクライオ電子顕微鏡で解析することにより、mRNAや周辺のリボソームサブユニット、アミノアシルtRNA、rRNAとの相互作用領域が、RPL3（構成型リボソーム）とRPL3L（横紋筋リボソーム）でどのように異なるかを解析する。HEK293T細胞にRPL3Lを過剰発現してからRPL3をノックアウトすることにより、横紋筋リボソームのみが存在する細胞の作製を試みたが、その様な細胞を得ることができなかった。

我们发现横纹肌同时含有含有 RPL3 的“组成性核糖体”和含有 RPL3L 的“横纹肌核糖体”。此外，Ribo-seq 分析显示，RPL3L KO 小鼠（横纹肌核糖体缺陷）表现出心肌收缩力降低，以及某些基因（包括参与心脏收缩的基因）的翻译活性降低。因此，该项目的目标是澄清“组成性核糖体”和“横纹肌核糖体”之间的质的差异。 [1] RPL3L KO小鼠心脏的时程观察和病理分析：在12周龄的RPL3L KO小鼠中观察到心肌收缩力显着下降，提示症状随着年龄的增长而恶化。症状恶化，也用10个月大的小鼠进行了分析，但没有观察到症状进一步恶化。此外，即使在对心脏施加压力超负荷后，也没有观察到进一步的恶化。 [2] 创建标签敲入小鼠并检查目标 mRNA 是否存在差异：我们创建了 HA 标签序列被敲入 RPL3 或 RPL3L 的小鼠。此外，我们使用敲入小鼠的心脏样本通过免疫沉淀纯化了 HA 标签抗体，并进行了 IP-Ribo-seq。 RPL3L-HA的IP-Ribo-seq显示，与RPL3-HA相比，与心脏收缩相关的基因更加丰富。 [3]通过冷冻电镜分析揭示结构基础：通过使用冷冻电镜分析横纹肌核糖体的结构，我们发现与mRNA、周围核糖体亚基、氨酰-tRNA和rRNA的相互作用区域是如何分析的RPL3（组成型核糖体）和 RPL3L（横纹肌核糖体）有所不同。我们尝试通过在HEK293T细胞中过表达RPL3L然后敲除RPL3来产生仅含有横纹肌核糖体的细胞，但我们无法获得这样的细胞。