遅発性神経細胞死における免疫・酵素組織化学的研究 -Ca^<2+>-ATPase抗体作製、砂ネズミ後脳虚血実験、リーラーマウス虚血モデルの作製-

延迟性神经细胞死亡的免疫学和酶组织化学研究 - Ca^2+-ATPase抗体制作、沙鼠后脑缺血实验、reeler小鼠缺血模型制作 -

基本信息

批准号：
07771113
负责人：
小黒恵司
金额：
$ 0.51万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.原形質膜Ca^<2+>-ATPase抗体の作製、免疫組織化学赤血球膜より蛋白を精製し、抗体作成の予定であったが、効率が悪く、蛋白を得るまでに多大な時間を要するため、以下のような分子生物学的手法により、蛋白を得、抗体を作成した。原形質膜Ca^<2+>-ATPaseにはtypeI-IVのサブタイプがあるが、分子量が約12Kと大きく、蛋白全体として精製することは難しい。従って、各々の活性部位のみを精製し、同部蛋白に対する抗体を作成した。生化学的な分析から、海馬にはtypeIIあるいはIが多く発現していることが予想され、先ず、typeII抗体作製を行った。(方法)(1)原形質膜Ca^<2+>-ATPaseのプローブを入手し、制限酵素を用いてCa^<2+>-ATPase分子を切断、活性部位のみのプローブを作製。(2)得られたプローブをベクターを用いて大腸菌に組み込み、大腸菌を増殖させ、Ca^<2+>-ATPase活性部位蛋白を発現させる。(3)菌体蛋白を可溶化し、ヒスチジンカラムを用いて目的蛋白のみを分離精製。(4)野兎を用いてpolyclonal抗体作製。ウエスタンブロッテイングによる特異性の検定。現在、typell抗体については(4)までを終了し、虚血砂ネズミにおいて免疫組織科学的検討を行っている。尚、以前、本研究費によって行った、同酵素の酵素組織化学的検討の結果をpublishした。2.砂ネズミ後脳虚血モデルの実験砂ネズミの椎骨動脈は非常に細く、確実に閉塞することが難しい。現在、Hataら(1994)の両側鎖骨下動脈閉塞法の手技習熟に努めている。3.リーラーマウス遅発性神経細胞死モデルの作製リーラーマウスの椎骨動脈は砂ネズミよりさらに細く、閉塞はさらに困難である。前記の手技獲得により、4vesseles occulusionを実現したい。4.砂ネズミ海馬スライスを用いた電気生理学的実験本年度は新たに、電気生理学的実験を開始し、遅発性神経細胞死におけるグルタミン酸受容体の関わりを明らかにして行く予定である。

1。质膜Ca^<2+> - ATPase抗体的制备，免疫组织化学从红细胞膜上纯化蛋白质以制备抗体，但效率效率低下，但是花了很多时间才能获得蛋白质，因此获得了蛋白质，因此得到了蛋白质和抗体，因此由抗体制备了抗体。质膜Ca^<2+> - ATPase具有I型I-IV的亚型，但其大分子量约为12K，因此很难纯化整个蛋白质。因此，仅将每个活性位点纯化以生成针对同一蛋白质的抗体。生化分析表明，在海马中表达了大量II型或I，首先制备了II型抗体。（方法）（1）我们获得了质膜Ca^<2+> - ATPase的探针，并使用限制性酶裂解Ca^<2+> - ATPase分子分子，以创建使用活性位点的探针。（2）使用载体将获得的探针掺入大肠杆菌中，并生长大肠杆菌，并表达Ca^<2+> - ATPase活性位点蛋白。（3）溶解细菌蛋白，并仅使用组氨酸柱分离并纯化靶蛋白。（4）使用兔子制备多克隆抗体。通过蛋白质印迹测试特异性。目前，我们已经完成了（4）的类型抗体的程序，并在缺血性砂小鼠中进行了免疫组织化学研究。此外，先前在这项研究基金进行的酶组织化学研究结果。 2。砂小鼠的实验实验后脑缺血模型砂小鼠的椎动脉非常薄且难以闭塞。目前，Hata等人。（1994年）正在努力掌握双侧下动脉闭塞技术。 3.在雷勒小鼠中创建一个模型，用于雷勒小鼠的静脉神经元死亡。卷轴小鼠的椎动脉甚至比沙鼠更薄，这使得它们更难以阻断。通过获取上述技术，我们希望实现4Vesseles Occulusion。 4。今年使用沙鼠海马切片的电生理实验，我们计划开始一项新的电生理实验，以阐明谷氨酸受体在神经元晚期死亡中的参与。