ヒトN-アセチルガラクトサミン転移酵素の遺伝子クローニングと細胞内局在の検討

人N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因克隆及细胞内定位研究

基本信息

批准号：
07770368
负责人：
西森功
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kochi Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770368/
关键词：
糖転移酵素 Nアセチルガラクトサミン cDNA 胃癌大腸癌膵癌細胞内局在

项目摘要

1.ヒトUDP-GalNAc:polypeptideN-アセチルガラクトサミン転移酵素(以下GalNAc transferaseと略す)のcDNA全配列の解明:既報のbovine GalNAc transferaseのcDNA配列をもとにRT-PCR法によりヒトGalNAc transferasの部分cDNA(897bp)を得た。さらに、cDNA全長のクローニングを行っていたところ、ClausenらによりヒトGalNAc transferaseの2つのisozyme (T1,T2)の全cDNA配列が報告された(J Biol Chem 1995;270:24156)。我々のクローニングしたGalNAc transferaseはClausenらのT1に相当し、またcDNA配列も100%同じであった。2.T1-GalNAc transferaseに対するモノクローナル抗体の作製:T1-GalNAc transferaseのcDNA配列を基にペプタイドを合成し(23アミノ酸残基)、このペプタイドに対するマウスモノクローナル抗体(GNT-1,IgM)を作製した。3.消化器癌培養細胞におけるT1-GalNAc transferase蛋白発現の検討:GNT-1を用い、培養癌細胞(胃癌;HTB135,大腸癌;HT29,膵癌;PANC-1,BxPC3)における同酵素蛋白の発現をWestern immunoblot法により検討した。その結果、HT29およびBxPC3において71,72,78kDのmoleculeに反応を認めたのに対し(HT29では71,72kD、BkPC3では78kDに強い反応)、HTB135およびPANC-1では反応が認められず、T1-GalNAc transferaseの蛋白発現は臓器間、および腫瘍間で異なることが示された。これは癌細胞における糖鎖構造の変異が糖転移酵素の量的相違による可能性を示唆するものであり、現在、各種癌組織において同酵素蛋白の発現を免疫組織学的に検討中である。4.免疫電子顕微鏡によるT1-GalNAc transferase蛋白の細胞内局在の検討:GNT-1を用いた免疫電子顕微鏡により、ヒト正常顎下腺腺房細胞および膵癌培養細胞(BxPC3)において細胞質内に酵素反応物のdiffuseな分布を認めた。現在、金コロイドを用いた方法により再確認中である。

1.人UDP-GalNAc：多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶（以下简称GalNAc转移酶）完整cDNA序列的阐明：根据先前报道的牛GalNAc转移酶的cDNA序列，通过RT-PCR确定了人GalNAc转移酶的部分cDNA序列。获得PCR方法(897bp)。此外，在全长 cDNA 克隆过程中，Clausen 等人报道了人 GalNAc 转移酶的两种同工酶（T1、T2）的完整 cDNA 序列（J Biol Chem 1995；270：24156）。我们克隆的GalNAc转移酶与Clausen等人的T1相对应，cDNA序列也100%相同。 2.抗T1-GalNAc转移酶单克隆抗体的制备：根据T1-GalNAc转移酶的cDNA序列合成肽（23个氨基酸残基），并制备抗该肽的小鼠单克隆抗体（GNT-1，IgM）。 3.检测培养的胃肠道癌细胞中T1-GalNAc转移酶蛋白表达：使用GNT-1，在培养的癌细胞（胃癌；HTB135，结直肠癌；HT29，胰腺癌；PANC-1，BxPC3）中相同酶蛋白的表达）使用Western免疫印迹方法进行研究。结果，在HT29和BxPC3中观察到与71,72,78kD的分子发生反应(与HT29中的71,72kD和BkPC3中的78kD强烈反应)，但与HTB135和PANC-1以及T1-GalNAc没有观察到反应。研究表明，转移酶蛋白的表达在器官和肿瘤之间存在差异。这表明癌细胞中糖链结构的突变可能是由于糖基转移酶的数量差异造成的，我们目前正在利用免疫组织化学技术研究这种酶蛋白在各种癌症组织中的表达。 4.免疫电镜检查T1-GalNAc转移酶蛋白的细胞内定位：使用GNT-1的免疫电镜显示该酶在正常人颌下腺腺泡细胞和培养的胰腺癌细胞(BxPC3)的细胞质中呈弥漫性分布。观察到反应物。我们目前正在使用胶体金的方法再次确认这一点。