マウス大腸癌肝転移モデルを用いた転移形質の解析

小鼠结直肠癌肝转移模型的转移特征分析

基本信息

批准号：
03J61511
负责人：
加藤健太郎
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

癌が転移性を獲得すると癌細胞表面上の糖タンパク質の発現変化が起こる。上皮性の固形癌におけるこれらのマーカー糖タンパク質はO-結合型糖鎖を多く有するムチンであるが、癌の進行による変化がムチンコア蛋白遺伝子の発現変化によるか、糖鎖構造の変化によるかは明らかでない。O-結合型糖鎖構築はN-アセチルガラクトサミン転移酵素(pp-GalNAc-Ts)によってタンパク質上のセリン(Ser)あるいはスレオニン(Thr)残基にN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)が転移して開始される。私は癌の進行に伴うpp-GalNAc-Tsの発現変化がムチンの構造と発現に影響を及ぼすと考え、大腸などに多く発現し、Thrを多く含む分泌型ムチン(MUC2)へのGalNAc付加の規則性について研究してきた。マウス大腸癌細胞株colon38とその肝高転移株SL4における既知のマウスpp-GalNAc-Tsの遺伝子発現レベルをcompetitive RT-PCR法を用いて比較したところ、pp-GalNAc-T1、T2、T4、T7の発現はSL4細胞の方がcolon 38細胞よりもわずかに高かったのに対し、pp-GalNAc-T3の発現はcolon 38細胞の方がSL4細胞よりも65倍高いことを明らかにした。両細胞の細胞表面糖鎖の違いは種々のレクチンの結合性の違いにより明らかになっており、pp-GalNAc-Tsの発現変化による糖鎖抗原発現への影響が考えられた。両細胞のミクロソーム画分を酵素源とし、MUC2ペプチドを基質としてGalNAc付加数およびGalNAc付加位置を調べたところ、ペプチド上のGalNAc付加位置は両細胞間で異なり、最大GalNAc付加数はcolon 38細胞ミクロソーム画分を酵素源とした場合は6個であったのに対し、SL4細胞ミクロソーム画分を用いた場合は4個であることを明らかにした。また、pp-GalNAc-T3のみをcolon 38細胞ミクロソーム画分から免疫沈降法により除いた場合、MUC2ペプチドに対する最大GalNAc付加数が4個になったことから、両細胞の糖鎖修飾の違いがpp-GalNAc-T3の発現量の差を反映していると考えられた。さらに、pp-GalNAc-T3をSL4細胞に遺伝子導入し、ムチン発現・細胞表面糖鎖・転移性・増殖性に変化がみられるか検討した。

当癌症获得转移特性时，癌细胞表面糖蛋白的表达会发生变化。上皮实体癌中的这些标记糖蛋白是具有许多O-连接糖链的粘蛋白，但尚不清楚癌症进展引起的变化是由于粘蛋白核心蛋白基因表达的变化还是糖链结构的变化。 O-连接糖链的构建是通过 N-乙酰半乳糖胺转移酶 (pp-GalNAc-Ts) 将 N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 转移到蛋白质上的丝氨酸 (Ser) 或苏氨酸 (Thr) 残基来启动的。我相信与癌症进展相关的 pp-GalNAc-T 表达的变化会影响粘蛋白的结构和表达，并且我相信将 GalNAc 添加到分泌性粘蛋白 (MUC2) 中，该粘蛋白在大肠中大量表达并包含大量的Thr，我一直在研究规律性。采用竞争性RT-PCR比较已知小鼠pp-GalNAc-Ts在小鼠结肠癌细胞系colon38及其高转移肝细胞系SL4中的基因表达水平，发现pp-GalNAc-T1、T2、T4、T7的表达水平-GalNAc-T3在SL4细胞中比在结肠38细胞中稍高，而pp-GalNAc-T3在结肠38细胞中的表达比在结肠38细胞中稍高。发现38细胞比SL4细胞高65倍。通过各种凝集素的结合特性的差异揭示了两种细胞之间细胞表面糖链的差异，并且pp-GalNAc-Ts表达的变化被认为对糖链抗原表达有影响。使用两种细胞的微粒体部分作为酶源，以MUC2肽作为底物，我们研究了肽上GalNAc添加的数量和位置，发现两种细胞之间肽上GalNAc添加的位置不同，并且当使用该级分作为酶源时，在结肠38细胞微粒体中发现添加的GalNAc的最大数量为6，而当使用SL4细胞微粒体级分时，该数量为4。此外，当通过免疫沉淀仅从结肠38细胞微粒体级分中去除pp-GalNAc-T3时，MUC2肽中GalNAc添加的最大数量为4，这表明两个细胞之间糖基化的差异是由于pp-GalNAc造成的-T3。这被认为反映了GalNAc-T3的表达水平的差异。此外，我们将pp-GalNAc-T3转染至SL4细胞中，并检查粘蛋白表达、细胞表面糖链、转移和增殖是否有任何变化。