出芽酵母の生育に必須な新規アクチン関連タンパク質Act3pの細胞内機能の解析

Act3p（一种酿酒酵母生长必需的新型肌动蛋白相关蛋白）的细胞内功能分析

基本信息

批准号：
07760070
负责人：
原田昌彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Act3pに特異性が高く,通常のアクチンや他のアクチン関連タンパク質には反応しない抗体を得るため,Act3pに特異的な挿入アミノ酸配列をコードするACT3遺伝子部分を“QIAexpresssystem"に導入することにより、ヒスチジンのタグ部分を含む融合タンパク質遺伝子をプラスミド上に構築した。このプラスミドを導入した大腸菌を大量培養することにより,Act3p融合タンパク質を得た.この融合タンパク質をNi-NATカラムを用いて精製し,これを兎に免疫することにより,Act3pに特異的に結合するポリクローナル抗体を作製した.この抗体を用い,酵母の抽出液に対してウエスタンブロットを行ったところ,Act3pはSDS-PAGEにおいて55kDaのタンパク質として検出された.これは,アミノ酸配列から予想される分子量54.8kDaに非常に近い値である.固定した出芽酵母の細胞壁を酵素的に溶解してスフェロプラスト化した後,スライドグラス上で螢光抗体法を行なった.螢光顕微鏡下でAct3pの細胞内局在性を観察し,DAPIによる核の染色と比較したところ,大部分のAct3pが核に存在しいることが示された.このAct3pの核への局在は,酵母から単離した核を用いたウエスタンブロットによっても示された.さらに,酵母からの単離核を,0.5MNaClあるいはDNaselで処理することによりAct3pが核から可溶化することがウエスタンブロットにより示された.これはAct3pが核内でクロマチンに結合して存在していることを示唆しており,Act3pが酵母の生育に必須であることと考え合わせ,Act3pが核内でクロマチンの構築において重要な機能を有している可能性がある.今後,Act3pと相互作用する分子の同定・解析が必要であると考えている。

为了获得对 Act3p 高度特异性且不与正常肌动蛋白或其他肌动蛋白相关蛋白发生反应的抗体，我们将编码 Act3p 特异性插入氨基酸序列的 ACT3 基因部分引入到 QIAexpress 系统中。在质粒上构建含有标签部分的基因。通过大量培养导入该质粒的大肠杆菌，使用Ni-NAT柱纯化该融合蛋白，并通过用其免疫兔子，发现其与Act3p A特异性结合。使用该抗体制备多克隆抗体，对酵母提取物和Ac进行蛋白质印迹分析。通过 SDS-PAGE 检测到 T3p 为 55 kDa 蛋白，与氨基酸序列预测的 54.8 kDa 分子量非常接近。此后，我们在载玻片上进行了荧光抗体测定，观察了细胞内定位。在荧光显微镜下观察 Act3p，并确定 D与API核染色的比较表明，Act3p的这种核定位也通过使用从酵母分离的细胞核进行的蛋白质印迹来证明。此外，还表明通过处理分离的细胞核，Act3p从细胞核中溶解。来自含有 0.5M NaCl 或 DNasel 的酵母。这表明Act3p在细胞核中与染色质结合存在，并且考虑到Act3p对于酵母生长至关重要，Act3p在细胞核中与染色质结合可能在Act3p的构建中具有重要功能。我们认为有必要对其进行鉴定。并分析未来与 Act3p 相互作用的分子。