出芽酵母の核に局在する新規アクチンファミリータンパク質分子間相互作用の解析

位于酿酒酵母细胞核中的新型肌动蛋白家族的蛋白质-分子相互作用分析

基本信息

批准号：
09760066
负责人：
原田昌彦
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

Act3pは酵母の生育に必須なアクチン関連タンパク質(Actin-Related Protein:Arp)であり、そのアミノ酸配列のほぼ全域でアクチンに相同性を示すが、2ケ所に他のアクチンファミリータンパク質には存在しない挿入ペブチド領域がある。Act3pは核に局在しており、遺伝子発現制御への関与が示唆されている。Act3pのカルボキシ末端にヒスチジンタグを付加してゲノム上のACT3遺伝子と相同組換えを行うことで、Act3p-His6を発現する酵母株を作製した。この株の抽出液から、Ni-NTAカラムを利用して、Act3p-His6が含まれるタンパク質複合体を単離した。この両分をさらにゲルろ過カラムで分画し、抗Act3p抗体を用いてウエスタンプロットを行い、Act3pがおよそ300kDaのタンパク質複合体に含まれていることが示された。現在、このタンパク質複合体に含まれるタンパク質の解析を行っている。Act3pのアミノ酸配列の情報を用いてヒトESTデータベースをスクリーニングしたところ、Act3pに相同性を有する2つの配列が見い出された。これらの全長の配列を決定したところ、これらは互いに94%相同な新規Arpのアイソフォームであり、これらをhArpNα,βと名付けた。hArpNα,βとGFPとの融合タンパク質をHeLa細胞で発現させたところ、両者とも核への局在が観察され、ユウクロマチン領域にその多くが存在していた。さらに、hArpNα,βの組織特異的な発現をRT-PCRを用いて解析したところ、hArpNβは様々な組織で広く発現が認められるのに対し、hArpNαは脳でのみ発現していることが示された。hArpNα,βが出芽酵母Act3pと同じクラスに属するかについてはさらに検討が必要であるが、これらの結果は、ARPが脊椎動物の核機能にも関与しており、さらに組織特異的な機能をも有している可能性を示している。

ACT3P是肌动蛋白相关的蛋白质（ARP），对于酵母生长必不可少，尽管它在几乎整个氨基酸序列中表现出同源的肌动蛋白，但在其他肌动蛋白家族蛋白中不存在的两个位置插入Pestide区域。 ACT3P位于原子核中，表明其参与基因表达调节。通过在ACT3P的羧基末端添加组氨酸标签，并与基因组上的ACT3基因同型重组，从而产生了表达ACT3P-HIS6的酵母菌菌株。从该菌株的提取物中，使用Ni-NTA色谱柱分离了含有ACT3P-HIS6的蛋白质复合物。这两者都是在凝胶过滤柱上进一步分级的，并使用抗ACT3P抗体绘制了西部，表明ACT3P包含在约300 kDa的蛋白质复合物中。当前，我们正在对该蛋白质复合物中包含的蛋白质进行分析。当使用有关ACT3P的氨基酸序列筛选人类EST数据库时，发现两个具有与ACT3P同源的序列。确定了这些全长序列，它们彼此同源94％，并被指定为HARPNα，β。当HarPNα，β和GFP的融合蛋白在HeLa细胞中表达时，两者都观察到对细胞核的定位，其中许多都存在于整体素区域。此外，使用RT-PCR分析了HARPNα，β的组织特异性表达，并表明HARPNβ在多种组织中广泛表达，而HarPNα仅在大脑中表达。需要进一步研究以确定HARPNα，β是否属于与萌芽的酵母ACT3P同一类，但这些结果表明ARP也参与脊椎动物的核功能，并且可能具有组织特异性功能。