出芽酵母の核に局在する新規アクチンファミリータンパク質分子間相互作用の解析

位于酿酒酵母细胞核中的新型肌动蛋白家族的蛋白质-分子相互作用分析

基本信息

批准号：
09760066
负责人：
原田昌彦
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

Act3pは酵母の生育に必須なアクチン関連タンパク質(Actin-Related Protein:Arp)であり、そのアミノ酸配列のほぼ全域でアクチンに相同性を示すが、2ケ所に他のアクチンファミリータンパク質には存在しない挿入ペブチド領域がある。Act3pは核に局在しており、遺伝子発現制御への関与が示唆されている。Act3pのカルボキシ末端にヒスチジンタグを付加してゲノム上のACT3遺伝子と相同組換えを行うことで、Act3p-His6を発現する酵母株を作製した。この株の抽出液から、Ni-NTAカラムを利用して、Act3p-His6が含まれるタンパク質複合体を単離した。この両分をさらにゲルろ過カラムで分画し、抗Act3p抗体を用いてウエスタンプロットを行い、Act3pがおよそ300kDaのタンパク質複合体に含まれていることが示された。現在、このタンパク質複合体に含まれるタンパク質の解析を行っている。Act3pのアミノ酸配列の情報を用いてヒトESTデータベースをスクリーニングしたところ、Act3pに相同性を有する2つの配列が見い出された。これらの全長の配列を決定したところ、これらは互いに94%相同な新規Arpのアイソフォームであり、これらをhArpNα,βと名付けた。hArpNα,βとGFPとの融合タンパク質をHeLa細胞で発現させたところ、両者とも核への局在が観察され、ユウクロマチン領域にその多くが存在していた。さらに、hArpNα,βの組織特異的な発現をRT-PCRを用いて解析したところ、hArpNβは様々な組織で広く発現が認められるのに対し、hArpNαは脳でのみ発現していることが示された。hArpNα,βが出芽酵母Act3pと同じクラスに属するかについてはさらに検討が必要であるが、これらの結果は、ARPが脊椎動物の核機能にも関与しており、さらに組織特異的な機能をも有している可能性を示している。

Act3p是一种对酵母生长至关重要的肌动蛋白相关蛋白（Arp），几乎在整个氨基酸序列上都显示出与肌动蛋白的同源性，但有两个其他肌动蛋白家族蛋白中不存在的插入片段。 Act3p 位于细胞核中，有人认为它参与基因表达调控。通过在Act3p的羧基末端添加组氨酸标签并与基因组上的ACT3基因进行同源重组来创建表达Act3p-His6的酵母菌株。使用 Ni-NTA 柱从该菌株的提取物中分离出含有 Act3p-His6 的蛋白质复合物。使用凝胶过滤柱进一步分离这两个级分，并使用抗Act3p抗体进行蛋白质印迹，结果显示Act3p包含在约300kDa的蛋白质复合物中。我们目前正在分析该蛋白质复合物中所含的蛋白质。当我们利用Act3p的氨基酸序列信息筛选人类EST数据库时，我们发现了两条与Act3p具有同源性的序列。测定了它们的全长序列，发现它们是新的Arp亚型，彼此同源性高达94％，并将它们命名为hArpNα，β。当hArpNα、β和GFP的融合蛋白在HeLa细胞中表达时，观察到这两种蛋白均定位于细胞核，并且大部分存在于常染色质区域。此外，当使用RT-PCR分析hArpNα,β的组织特异性表达时，表明hArpNβ在各种组织中广泛表达，而hArpNα仅在脑中表达。虽然还需要进一步研究以确定 hArpNα,β 是否与酿酒酵母 Act3p 属于同一类，但这些结果表明 ARP 也参与脊椎动物的核功能，并且可能还具有组织特异性功能。。