ミオシンATPaseの遷移状態を形成する複合体の^<19>F-NMRによる解析

^19F-NMR分析形成肌球蛋白ATP酶过渡态的复合物

• 批准号: 07780582
• 负责人: 丸田 晋策
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Soka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780582/
• 关键词: 筋収縮; ミオシンATPase; エネルギートランスダクション; 遷移状態アナログ; ATPアナログ; ^<19>F-NMR

(1)a.ATPアナログ2-[(4-trifluoro-methyl-2-nitrophenyl)amino]ethyl triphosphate(TFNTP)を用いて形成させたミオシン/TFNDP/AIF_4BeFn or Vi複合体の^<19>F-NMRスペクトルの化学シフトはそれぞれわずかであるが、異なっていた。TFNDPに非常に近い性質を持つ光架橋性のMant-2-N_3-ATPを用いた各複合体の光親和標識の実験結果は、各複合体においてプロテアーゼ消化によって得られる同じペプチドに架橋することが示されたので、活性部位において大きなコンホメーションの差はないと思われる。しかしTFNDPの^<19>F-NMRスペクトルはアミノ酸レベルでの小さな変化をとらえていることが示唆された。b.フッ素で標識した平滑筋ミオシン制御軽鎖のmutant(F22W)を遺伝子操作を用いて直接フッ素標識して^<19>F-NMRの測定を行なった。標識された制御鎖のスペクトルはフリーのものと異なる化学シフトを示し、特異的に標識された部位の構造をモニターできることが示唆された。またnativeミオシンと効率良くexchangeすることができた。今後、このミオシンを用いて複合体を形成させて^<19>F-NMRを測定する予定である。(2)ミオシン/ADP/AIF_4(BeFn,Vi)複合体を形成するミオシン頭部,Subfragment-1(S-1)の全体的な構造を調べるために、X線小角散乱法を用いて各複合体におけるS-1分子の慣性半径を小角領域のギニエプロット(散乱曲線を、強度の対数を縦軸に散乱ベクトルの大きさの二乗を横軸にプロットしたもの)の勾配から求めた。各複合体ともATPが結合したときと同程度の構造変化を起こしており、ミオシン頭部で折れ曲がりを示すような構造をすることが示唆された。また活性システイン残基Cys707(SH1)が存在する部位での、局所的な構造変化を調べるために、あらかじめ蛍光試薬ABDFで標識したミオシンを調製して、ADPと各リン酸アナグロを加えて各複合体形成に伴う構造変化を調べた。いずれの複合体においても同程度の構造変化を示していることが示された。各複合体はATPが結合したとき、遷移状態形成に近い構造変化をミオシン頭部全体及びSH1領域で起こしていることが示された。しかしながら、活性リジン(Lys83)の反応性はそれぞれ異なっていることから、これらの複合体は収縮サイクルにおいて遷移状態付近に類似しているが、わずかにずれたステップを示していると考えられる。

(1)使用ATP类似物2-[(4-三氟-甲基-2-硝基苯基)氨基]乙基三磷酸(TFNTP)形成的肌球蛋白/TFNDP/AIF_4BeFn或Vi复合物的a.^ 19 F-中的化学位移NMR 谱轻微但不同。使用具有与 TFNDP 非常相似的性质的光交联 Mant-2-N_3-ATP 对每个复合物进行光亲和标记的实验结果表明，每个复合物都可以与通过蛋白酶消化获得的相同肽交联，如图所示。活性位点没有重大构象差异。然而，有人认为TFNDP的 19 F-NMR谱捕获了氨基酸水平的微小变化。 b.使用基因操作直接氟标记的平滑肌肌球蛋白调节轻链突变体(F22W)并进行19 F-NMR测量。标记控制链的光谱显示出与游离控制链不同的化学位移，这表明可以监测特定标记位点的结构。它还能够有效地与天然肌球蛋白进行交换。将来，我们计划使用该肌球蛋白形成复合物并测量^ 19 F-NMR。 (2)为了研究形成肌球蛋白/ADP/AIF_4(BeFn,Vi)复合物的肌球蛋白头Subfragment-1(S-1)的整体结构，每个复合物为S-的惯性半径根据小角度区域的吉尼尔图（以强度的对数为纵轴、以散射矢量大小的平方为横轴绘制的散射曲线）的斜率求出体内的1分子。每个复合物都会经历与 ATP 结合时相同程度的结构变化，表明肌球蛋白头部形成弯曲结构。此外，为了研究活性半胱氨酸残基Cys707（SH1）存在位点的局部结构变化，预先制备了用荧光试剂ABDF标记的肌球蛋白，并将ADP和各磷酸类似物添加到各复合物中。我们研究了与身体形成相关的结构变化。结果表明，两种复合物显示出相似的结构变化。结果表明，当 ATP 结合时，每个复合物都会经历类似于整个肌球蛋白头和 SH1 区域过渡态形成的结构变化。然而，活性赖氨酸 (Lys83) 的不同反应性表明这些复合物代表收缩周期中过渡态附近的类似但略有偏移的步骤。

项目成果

Maruta et al.: "Conformational change on myosin head induced by binding of ATP analogue which has “Syn" conformation at N-glyciside bond" Biophysical Journal. 70. 265 (1996)

Maruta 等人：“N-糖苷键上具有“Syn”构象的 ATP 类似物的结合诱导肌球蛋白头部的构象变化”《生物物理学杂志》70. 265 (1996)。

Maruta et al.: "Analysis of conforamtional change of smooth muscle myosin regulatory light chain accompanied with phosphorylation using ^<19>F-NMR" Biophysical Journal. 70. 267 (1996)

Maruta等人：“使用19F-NMR分析伴随磷酸化的平滑肌肌球蛋白调节轻链的构象变化”生物物理学杂志。