脱窒細菌の産出する新種のアズリンのX線構造解析と生体内電子伝達機構の解明

反硝化细菌产生的新种天青蛋白的X射线结构分析及体内电子传递机制的阐明

基本信息

批准号：
07780572
负责人：
井上豪
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

脱窒菌Achromobacter xylosoxidans NCIB 11015の産出する電子伝達タンパク質アズリンは菌体内にただ1種類のみその存在がしられていたが、X線構造解析によって2種のアズリンが存在することを明らかとした。従来法で精製したが、種結晶化法を用いたため、2種のうちただ1種のみが結晶化したと考えられる。2.5Å分解能でのX線構造解析の結果、得られた電子密度は以前報告されていたアミノ酸配列と一致しないことから、本結晶が新種のアズリンの結晶であること、またその構造情報を新知見としていち早く論文投稿したが、その後英国Montfort大学のDr.S.Hasnainらのグループが我々と同一のタンパク質を使って1.9Å分解能での構造を発表した。しかし、報告された銅イオンの配位構造は、ステラシアニン以外のすべてのブルー銅タンパク質の配位子であるメチオニンが配位しておらず、我々の解析結果とは異なってた。現在我々も1.8Å分解能までのデータ収集を行い、より精度の高い構造精密化を進めている。また、アズリン1についても世界で初めて結晶化に成功した。X線回折実験を行い、この結晶は空間群がC2の単斜晶系に属し、格子定数もa=130.3,b=54.2,c=75.0Åであることがわかった。分子置換法による構造解析にも成功し、非対称単位中に存在する4分子の配向を決定することにも成功し、現在2.5Å分解能での精密化を進めている。これらは両アズリンの構造精密化を進めた後、合わせて論文報告を行う予定である。また、同じ脱窒菌に属するAchromobacter xylosoxidans GIFU1051についても新種のアズリンが存在する可能性が示唆されたため、GIFU由来の亜硝酸還元酵素およびアズリンを精製した。精製方法を検討した結果、本菌体からも新種のアズリンが精製された。同一菌体内に種類の異なるアズリンが存在することが発見されたのは、C1資化性菌Methylomonas J、脱窒菌Achomobactere xylosoxidans NCIBに次いで3種目となった。これら亜硝酸還元酵素、アズリン1.、アズリン2は本年度すべて結晶化に成功し、現在、それぞれ2.0Å、2.5Å、2.0Å分解能での構造解析を進めている。

据了解，细菌细胞内仅存在一种天青蛋白，即反硝化细菌木糖氧化无色杆菌 NCIB 11015 产生的电子转移蛋白，但 X 射线结构分析表明存在两种类型的天青蛋白。使用常规方法进行纯化，但由于使用种子结晶法，因此认为两种物质中仅一种结晶。 2.5 Å分辨率的X射线结构分析结果显示，获得的电子密度与之前报道的氨基酸序列不匹配，这表明该晶体是一种新型的天青蛋白晶体，并且获得了新的结构信息。英国蒙特福特大学的 S. Hasnain 博士小组使用与我们相同的蛋白质以 1.9 Å 的分辨率发表了该结构。然而，报道的铜离子配位结构与我们的分析结果不同，因为蛋氨酸是除星花青蛋白之外的所有蓝铜蛋白的配体，没有配位。目前，我们正在收集高达 1.8 Å 分辨率的数据，并正在进行更精确的结构细化。我们还在世界上首次成功结晶了 Azurin 1。 X射线衍射实验表明，该晶体属于C2空间群的单斜晶系，晶格常数为a=130.3、b=54.2、c=75.0Å。我们成功地使用分子置换法进行了结构分析，并成功确定了不对称单元中存在的四个分子的方向，目前正在以 2.5 Å 分辨率进行精细化。在进一步完善这两种天青蛋白的结构后，我们计划在一篇论文中对此进行报告。此外，有人认为木糖氧化无色杆菌GIFU1051中可能存在一种新的天青蛋白，它属于同一反硝化细菌，因此我们纯化了GIFU来源的亚硝酸还原酶和天青蛋白。通过检查纯化方法，从该细菌细胞中纯化出了一种新型天青蛋白。这是继 C1 同化细菌甲基单胞菌 J 和反硝化细菌木糖氧化无杆菌 NCIB 之后发现的第三种存在于同一细菌体内的天青蛋白。这些亚硝酸还原酶天青蛋白 1 和天青蛋白 2 今年均已成功结晶，目前正在进行分辨率分别为 2.0 Å、2.5 Å 和 2.0 Å 的结构分析。