クライオ電顕を用いた時分割構造解析による破傷風毒素の膜侵入機構解明

使用冷冻电镜进行时间分辨结构分析，阐明破伤风毒素的膜侵袭机制

基本信息

批准号：
22H02557
负责人：
井上豪
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

破傷風毒素（TeNT）は、同じClostridium属のボツリヌス毒素（BoNT）と細胞膜透過の分子機構が同一であるにも関わらず、BoNTが末梢神経系で作用するのに対してTeNTは中枢神経系のみで働くことが知られている。本申請では、還元型（不活性型）の破傷風毒素（TeNT）をクライオ電顕で用いるグリッドに固定化し、低pH下で酸化剤を添加して酸化型（活性型）へと構造変化させた場合の変化の過程を低温トラップ法で解析し、中枢神経系のみで膜侵入が起こる分子機構について考察することを目的としている。本目的を達成するためには、令和３年度に導入したクライオ電顕を稼働させる必要があり、令和４年度はそのほぼ全てのエフォートを装置の立ち上げに注力した。測定装置の制御装置の部品交換をしたり、１つ１つ原因を検討してはそれを確認したりする作業を繰り返しながら測定装置の立ち上げを行った結果、令和４年度の年度末に入ってから漸く装置が稼働しはじめ、不安定ながらもTEM画像の連続撮影が可能となる場面が徐々に増えてきた。一方で他の測定装置を用いてグラフェンを酸化し、エポキシ基を導入したクライオ電顕用の新規グリッド（EG-Grid）を開発し、グラフェン膜上にタンパク質を固定化して効率よく構造解析が可能となることを実証し、欧文雑誌に投稿し受理された（Fujita, J. et al., Scientific Reports, 2023)。実際のEG-Grid上に破傷風毒素(TeNT)を固定化し、それに反応溶液を混合してから凍結するまでの時間を調節して構造変化を追う作業は令和５年度に持ち越すこととした。

众所周知，破伤风毒素（帐篷）仅在中枢神经系统中起作用，而BONT在外周神经系统中起作用，尽管细胞膜渗透的分子机制与同一属梭状芽胞杆菌的骨骼相同。该应用程序旨在分析固定在用于冷冻电子显微镜的网格上固定（不活跃的）破伤风毒素（不活跃）的破伤风毒素（Tent）的过程，并将结构更改为在低温TRAP方法下在低pH值下使用低温TRAP方法的氧化（活性），并考虑在哪种膜片上进行分子机制。为了实现这一目标，有必要操作2021年推出的冷冻电子显微镜，而在2022年，几乎所有的努力都集中在推出设备上。由于反复更换测量设备控制设备的一部分，检查原因并检查了每个原因，启动了测量设备，并且设备最终在2022财政年度末开始运行，尽管其不稳定的性质，但TEM图像持续拍摄的情况逐渐增加。另一方面，使用其他测量设备开发了用于冷冻电源显微镜的新网格（EG-GRID），以氧化石墨烯并引入环氧基团，并证明可以将蛋白质固定在石墨烯膜上以有效地在结构上进行结构上分析，并将其列入欧洲日记帐和接受（fujita，J。et Al。通过将破伤风毒素（帐篷）固定在实际的EG-GRID上，调整从混合反应溶液到冷冻的时间，然后将结构变化延续到2023财年的工作，从而调整了从混合反应溶液到冻结的时间来跟踪结构变化的工作。

项目成果

期刊论文数量（12）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Immobilization of β-cyclodextrin onto polypropylene nonwoven fabric based on photooxidative surface modification

基于光氧化表面改性的β-环糊精在聚丙烯非织造布上的固定化

DOI：
10.1038/s41428-022-00751-8
发表时间：
2023
期刊：
Polymer Journal
影响因子：
2.8
作者：
Yamamoto Keita;Asahara Haruyasu;Moriguchi Maiko;Inoue Tsuyoshi
通讯作者：
Inoue Tsuyoshi

クライオ電子顕微鏡ハンドブック

冷冻电子显微镜手册

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
Segawa Katsumori;21人;Nagata Shigekazu;渡部　聡　稲葉　謙次
通讯作者：
渡部　聡　稲葉　謙次

グラフェングリッド、グラフェングリッドの製造方法、構造解析対象物質の構造解析方法

石墨烯网格、石墨烯网格制造方法、结构分析靶材料的结构分析方法

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

除菌・消臭剤MA-Tの酸化制御技術を活用したクライオ電顕のツールの開発

利用消毒剂/除臭剂MA-T的氧化控制技术开发冷冻电镜工具

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Koutsogiannaki Sophia;Bu Weiming;Maisat Wiriya;Manzor Mariel;Zhang Zhikuan;Ohto Umeharu;Eckenhoff Roderic G.;Yuki Koichi;井上豪
通讯作者：
井上豪

除菌消臭剤MA-Tのメカニズム解明に基づく酸化制御技術の開発とその応用

阐明消毒除臭剂MA-T机理的氧化控制技术开发及其应用

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Koutsogiannaki Sophia;Bu Weiming;Maisat Wiriya;Manzor Mariel;Zhang Zhikuan;Ohto Umeharu;Eckenhoff Roderic G.;Yuki Koichi;井上豪;井上豪
通讯作者：
井上豪