インターフェロン誘導性RB・結合タンパク質のクローニング

干扰素诱导的RB/结合蛋白的克隆

• 批准号: 07772172
• 负责人: 田原 栄俊
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772172/
• 关键词: インターフェロン; RB; 細胞増殖

様々なヒト線維芽細胞を用いてインターフェロンによる細胞増殖の抑制時におけるRBのリン酸化および共沈タンパク質を免疫沈降法を用いて検討した。その結果、多くの線維芽細胞でRBのリン酸化が起こっているにも関わらず細胞増殖の抑制が観察された。これは、線維芽細胞においてインターフェロンによる細胞増殖抑制機構は、RBを介さない経路で起こっていることを示唆させる結果であった。さらに、インターフェロン処理した様々な線維芽細胞では約80KDa付近にRB抗体で免疫沈降されてくるタンパク質が検出された。つまり、80KDaのタンパク質が多くの細胞でインターフェロン処理によって誘導され、細胞増殖の抑制に関与している可能性が考えられた。この時、IFNβで処理した細胞ではDNA合成が抑制されていることも同時に確認している。これらの結果から、当研究の目的とするインターフェロン誘導性80KDaのタンパク質は様々な細胞で検出されたことから重要である可能性を確認できた。Two hybrid systemを用いてRBタンパク質と結合するタンパク質をクローニングするためRB融合タンパク質をDNA組換え法により作製した。スクリーニングに必要なインターフェロン処理TIG-3細胞由来のcDNA libraryをリンカープライマー法によって作製した。これらを用いRBと結合するタンパク質をスクリーニングしており、いくつかその候補が得られているがin vitroでのタンパク質相互作用の確認までには至っていない。今後、これらのクローンについて詳細に検討する予定である。

使用各种人类成纤维细胞进行免疫沉淀，研究了干扰素抑制细胞增殖期间的RB磷酸化和共沉淀蛋白。结果，尽管RB在许多成纤维细胞中磷酸化，但仍观察到细胞增殖的抑制作用。这表明通过非RB介导的途径发生干扰素抑制细胞增殖的机制。此外，在约80 kDa的各种干扰素处理的成纤维细胞中检测到用RB抗体免疫沉淀的蛋白质。换句话说，人们认为在许多细胞中干扰素治疗可以诱导80kDa蛋白，并参与抑制细胞增殖。目前，还证实了DNA合成在用IFNβ处理的细胞中抑制。这些结果证实了干扰素诱导的80KDA蛋白，这是本研究的目的，在各种细胞中都检测到，因此可能很重要。通过DNA重组与使用两个杂交系统结合与RB蛋白的克隆蛋白的DNA重组制备RB融合蛋白。通过接头引物法制备了筛选所需的干扰素处理的TIG-3细胞的cDNA文库。这些已用于筛选与RB结合的蛋白质，并获得了一些候选物，但没有证实在体外证实蛋白质相互作用。我们计划将来详细考虑这些克隆。

项目成果

Hidetoshi Tahara: "Increase in expression levels of interferon-inducible genes in senescent human diploid fibroblasts and in SV40-transformed human fibroblasts with extended lifespan" Oncogene. 11. 1125-1132 (1995)

Hidetoshi Tahara：“衰老人二倍体成纤维细胞和寿命延长的 SV40 转化人成纤维细胞中干扰素诱导基因的表达水平增加”Oncogene。