電気化学法を用いた高感度な配列特異的遺伝子検出法の開発

利用电化学方法开发高灵敏度序列特异性基因检测方法

基本信息

批准号：
06750836
负责人：
井原敏博
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子工学における非RI化は実験者の安全性、環境問題はもとより、操作の簡便化、高速化にも繋がり、分子生物学の発展に寄与するところは計り知れないものがある。申請者は、酸化還元活性な金属錯体とオリゴヌクレオチド、あるいはインターカレータのコンジュゲートを合成した。合成した酸化還元活性オリゴヌクレオチドはターゲットDNA(1本鎖、2本鎖)と安定な錯体を形成する。この錯形成反応の熱力学的パラメータを複合体の融解曲線の解析と滴定型の熱測定装置を用いた2つの手法によって求めることができた。これによると、フェロセン修飾によって3本鎖複合体は2〜3kcal mol^<-1>の安定化を受けていることがわかった。恐らく、2本鎖のターゲットDNAのメジャーグルーブ内の塩基と、フェロセンをつなぐアミド結合部位の水素結合、あるいはリンカー部位の疎水的な相互作用が寄与したものであろう。修飾によって、錯生成反応のエンタルピーだけでなくエントロピーも比較的大きく変化したことにより、より協同性の高い結合となった。温度コントロールによるプローブのオンオフ制御を考えたときには非常に都合がよい。サイクリックボルタンメトリーにより電気化学挙動の基礎的な検討を行なった。その結果、フェロセン修飾オリゴヌクレオチドの酸化還元電位は、ターゲットの二次構造(1本鎖、2本鎖)やターゲットの前後のシークエンスにほとんど影響を受けないことがわかった。したがって、本プローブはこれらの事柄を全く考慮することなく検出系にそのまま応用できる。

基因工程中的非RI不仅是实验者的安全和环境问题，而且还导致简化和加速操作，并且其对分子生物学发展的贡献是不可估量的。申请人将氧化还原活性金属络合物与寡核苷酸或介导剂偶联物合成。合成的氧化还原活性寡核苷酸与靶DNA（单链，双链）形成稳定的复合物。该络合反应的热力学参数可以通过分析复合物的熔点和使用滴定温度计的两种方法来确定。这表明三链复合物通过二代代植物的修饰经历了2-3 kcal mol^-1>的稳定。在双链靶DNA的主要凹槽或接头位点的疏水相互作用的主要凹槽中，将酰胺结合位点与碱连接起来的酰胺结合位点的氢键可能。修改导致络合反应的焓的变化相对较大，而且导致熵的变化，从而导致更加合作的键。考虑使用温度控制，考虑探测器的ON/OFF控制时，这非常方便。使用环状伏安法进行了电化学行为的基本检查。结果，发现二茂铁修饰的寡核苷酸的氧化还原电势几乎不受目标（单链，双链）或目标之前和之后的靶标（单链，双链）或序列的影响。因此，该探针可以直接应用于检测系统，而无需考虑这些问题。