DNA修飾ナノスフェアの選択的凝集を利用する遺伝子の識別

利用 DNA 修饰纳米球选择性聚集的基因鉴定

基本信息

批准号：
11750704
负责人：
井原敏博
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA修飾超微粒子の調製表面にカルボキシル基を導入した直径約40nm、及び1μmのポリスチレン製のナノ微粒子(蛍光色素が含浸させてある)と末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド(ODN)を水溶性のカルボジイミドを用いてアミド結合を形成させることによりカップリングさせ、DNA修飾ナノスフェアを調製した。固液界面におけるハイブリダイゼーションに関する基礎研究直径1μmの微粒子を用いて、修飾するODNの種類、温度、塩濃度などの諸条件が微粒子表面でのハイブリダイゼーション効率に与える影響について検討した。その結果、有効なハイブリダイゼーションには塩基対形成に供されることのないリンカーの存在が不可欠であることが分かった。また、適当な温度、塩濃度条件下、1/15の変異(15塩基のうちの1塩基の変異)を導入したODNは微粒子に固定化したODNとほとんどハイブリダイズしないことが分かった。これは、微粒子上における固液間のハイブリダイゼーションが通常の液相におけるそれ同様の特異性を維持していることを意味する。微粒子の顕微鏡観察蛍光顕微鏡を用いてp53遺伝子試料(p53遺伝子の一部、ホットスポットを含む45量体)の検出実験を行った。緑と赤の蛍光を発する直径40nmの微粒子にそれぞれp53遺伝子の別の部位に相補的なODNを修飾した。分散溶液の塩濃度を上げると、これらの微粒子は凝集した。凝集体を蛍光顕微鏡で観察したところ、p53非存在下ではランダムに分散した赤と緑の塊が見られたが、p53共存下では黄色の凝集体のみが見られた。即ち、両微粒子はp53によって架橋されることで均一に集まり、その分布が完全に一致したために、赤と緑の合成色である黄色のみが観測できたと考えられる。遺伝子の簡便な多色アッセイの可能性を示すことができた。

DNA修饰超细颗粒的制备将直径约40 nm和1 μm的聚苯乙烯纳米颗粒（浸有荧光染料）表面引入羧基，与末端带有氨基的寡核苷酸（ODN）结合成水溶性DNA 修饰的纳米球是通过使用碳二亚胺形成酰胺键进行偶联而制备的。固液界面杂交的基础研究使用直径为1μm的微粒，研究了待修饰ODN的类型、温度和盐浓度等各种条件对固液界面杂交效率的影响。微粒子。结果发现，未进行碱基配对的接头的存在对于有效杂交是必需的。此外，发现在适当的温度和盐浓度条件下，引入1/15突变(15个碱基中的1个突变)的ODN几乎不与固定在微粒上的ODN杂交。这意味着微粒上的固液杂化保持了与正常液相中相同的特异性。微粒的显微观察我们利用荧光显微镜对p53基因样本（p53基因的一部分，含有热点的45聚体）进行了检测实验。发射绿色和红色荧光的直径为 40 nm 的微粒分别用与 p53 基因不同部分互补的 ODN 进行修饰。当分散溶液的盐浓度增加时，这些微粒聚集。当在荧光显微镜下观察聚集体时，在不存在p53的情况下看到随机分散的红色和绿色团块，但在存在p53的情况下仅看到黄色聚集体。换句话说，认为两个颗粒均通过p53交联并均匀聚集，并且它们的分布完全匹配，因此只能观察到红色和绿色的复合色黄色。我们能够证明简单的多色基因测定的可能性。