DNA修飾ナノスフェアの選択的凝集を利用する遺伝子の識別

利用 DNA 修饰纳米球选择性聚集的基因鉴定

基本信息

批准号：
11750704
负责人：
井原敏博
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA修飾超微粒子の調製表面にカルボキシル基を導入した直径約40nm、及び1μmのポリスチレン製のナノ微粒子(蛍光色素が含浸させてある)と末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド(ODN)を水溶性のカルボジイミドを用いてアミド結合を形成させることによりカップリングさせ、DNA修飾ナノスフェアを調製した。固液界面におけるハイブリダイゼーションに関する基礎研究直径1μmの微粒子を用いて、修飾するODNの種類、温度、塩濃度などの諸条件が微粒子表面でのハイブリダイゼーション効率に与える影響について検討した。その結果、有効なハイブリダイゼーションには塩基対形成に供されることのないリンカーの存在が不可欠であることが分かった。また、適当な温度、塩濃度条件下、1/15の変異(15塩基のうちの1塩基の変異)を導入したODNは微粒子に固定化したODNとほとんどハイブリダイズしないことが分かった。これは、微粒子上における固液間のハイブリダイゼーションが通常の液相におけるそれ同様の特異性を維持していることを意味する。微粒子の顕微鏡観察蛍光顕微鏡を用いてp53遺伝子試料(p53遺伝子の一部、ホットスポットを含む45量体)の検出実験を行った。緑と赤の蛍光を発する直径40nmの微粒子にそれぞれp53遺伝子の別の部位に相補的なODNを修飾した。分散溶液の塩濃度を上げると、これらの微粒子は凝集した。凝集体を蛍光顕微鏡で観察したところ、p53非存在下ではランダムに分散した赤と緑の塊が見られたが、p53共存下では黄色の凝集体のみが見られた。即ち、両微粒子はp53によって架橋されることで均一に集まり、その分布が完全に一致したために、赤と緑の合成色である黄色のみが観測できたと考えられる。遺伝子の簡便な多色アッセイの可能性を示すことができた。

DNA修饰的超细颗粒的制备DNA修饰的纳米层与聚苯乙烯纳米颗粒（用荧光染料浸没），其在地表上与寡核苷酸（ODN）在表面上引入的羧基（ODN）在末端使用氨基键合作使用Amide bone Amod carbodna ddna ddena ddena键。使用直径为1μM的细颗粒在固定液体界面上进行杂交的基础研究，我们研究了各种条件的影响，例如要修改的ODN类型，温度和盐浓度对微粒表面杂交效率的杂交效率。结果表明，不受碱基配对的接头的存在对于有效的杂交至关重要。还发现，在适当的温度和盐浓度条件下，在适当的温度和盐浓度条件下引入了1/15个突变（15个碱基之一的突变）的ODN，几乎没有用固定在细颗粒上的ODN杂交。这意味着细颗粒上的固液杂交在正常液相中保持相似的特异性。微颗粒的显微镜观察使用荧光显微镜进行了实验，以检测p53基因样品（p53基因的一部分，45mers含有热点）。直径为40 nm的绿色和红色荧光微粒分别用与p53基因的另一个位点互补的ODN修饰。在增加色散溶液的盐浓度后，这些细颗粒被聚集在一起。当使用荧光显微镜观察聚集体时，在没有p53的情况下发现了随机分散的红色和绿色肿块，但在存在p53的情况下仅看到黄色聚集体。也就是说，人们认为这两个细颗粒被p53交联以均匀地聚集，并且粒子的分布完全重合，因此只能观察到黄色的，红色和绿色的合成色。可以证明对基因的简单多色测定的可能性。